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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 7mi4 | ||||||
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タイトル | Symmetrical PAM-PAM prespacer bound Cas4/Cas1/Cas2 complex | ||||||
要素 |
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キーワード | HYDROLASE/DNA / CRISPR/Cas / Cas4 / PAM recognition / HYDROLASE-DNA complex | ||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 5' to 3' exodeoxyribonuclease (nucleoside 3'-phosphate-forming) / exonuclease activity / maintenance of CRISPR repeat elements / RNA endonuclease activity / 4 iron, 4 sulfur cluster binding / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||
生物種 | Geobacter sulfurreducens (バクテリア) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.2 Å | ||||||
データ登録者 | Hu, C.Y. / Ke, A.K. | ||||||
引用 | ジャーナル: Nature / 年: 2021 タイトル: Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR-Cas. 著者: Chunyi Hu / Cristóbal Almendros / Ki Hyun Nam / Ana Rita Costa / Jochem N A Vink / Anna C Haagsma / Saket R Bagde / Stan J J Brouns / Ailong Ke / 要旨: Prokaryotes adapt to challenges from mobile genetic elements by integrating spacers derived from foreign DNA in the CRISPR array. Spacer insertion is carried out by the Cas1-Cas2 integrase complex. A ...Prokaryotes adapt to challenges from mobile genetic elements by integrating spacers derived from foreign DNA in the CRISPR array. Spacer insertion is carried out by the Cas1-Cas2 integrase complex. A substantial fraction of CRISPR-Cas systems use a Fe-S cluster containing Cas4 nuclease to ensure that spacers are acquired from DNA flanked by a protospacer adjacent motif (PAM) and inserted into the CRISPR array unidirectionally, so that the transcribed CRISPR RNA can guide target searching in a PAM-dependent manner. Here we provide a high-resolution mechanistic explanation for the Cas4-assisted PAM selection, spacer biogenesis and directional integration by type I-G CRISPR in Geobacter sulfurreducens, in which Cas4 is naturally fused with Cas1, forming Cas4/Cas1. During biogenesis, only DNA duplexes possessing a PAM-embedded 3'-overhang trigger Cas4/Cas1-Cas2 assembly. During this process, the PAM overhang is specifically recognized and sequestered, but is not cleaved by Cas4. This 'molecular constipation' prevents the PAM-side prespacer from participating in integration. Lacking such sequestration, the non-PAM overhang is trimmed by host nucleases and integrated to the leader-side CRISPR repeat. Half-integration subsequently triggers PAM cleavage and Cas4 dissociation, allowing spacer-side integration. Overall, the intricate molecular interaction between Cas4 and Cas1-Cas2 selects PAM-containing prespacers for integration and couples the timing of PAM processing with the stepwise integration to establish directionality. | ||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 7mi4.cif.gz | 379.8 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb7mi4.ent.gz | 317.5 KB | 表示 | PDB形式 |
PDBx/mmJSON形式 | 7mi4.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 7mi4_validation.pdf.gz | 919.3 KB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 7mi4_full_validation.pdf.gz | 964.3 KB | 表示 | |
XML形式データ | 7mi4_validation.xml.gz | 60 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 7mi4_validation.cif.gz | 89.4 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/mi/7mi4 ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/mi/7mi4 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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1 |
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-要素
#1: タンパク質 | 分子量: 62598.496 Da / 分子数: 4 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Geobacter sulfurreducens (バクテリア) 株: ATCC 51573 / DSM 12127 / PCA / 遺伝子: cas4-cas1, GSU0057 / プラスミド: pET28bSUMO / 詳細 (発現宿主): kanamycin / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) 参照: UniProt: Q74H36, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素, 5' to 3' exodeoxyribonuclease (nucleoside 3'-phosphate-forming) #2: タンパク質 | 分子量: 11190.176 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Geobacter sulfurreducens (バクテリア) 株: ATCC 51573 / DSM 12127 / PCA / 遺伝子: cas2, GSU0058 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) 参照: UniProt: Q74H35, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 #3: DNA鎖 | 分子量: 10769.917 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Geobacter sulfurreducens (バクテリア) #4: 化合物 | #5: 化合物 | ChemComp-MN / 研究の焦点であるリガンドがあるか | Y | |
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-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 | 名称: Symmetrical PAM-PAM prespacer bound Cas4/Cas1/Cas2 complex タイプ: COMPLEX / 詳細: Cas4 recognizes PAM / Entity ID: #1-#3 / 由来: MULTIPLE SOURCES |
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分子量 | 値: 0.3 MDa / 実験値: YES |
由来(天然) | 生物種: Geobacter sulfurreducens (バクテリア) |
由来(組換発現) | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
緩衝液 | pH: 7.5 / 詳細: with 5 mM DTT |
緩衝液成分 | 濃度: 150 mM / 名称: sodium chloride / 式: NaCl |
試料 | 濃度: 1 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES |
試料支持 | 詳細: normal / グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 300 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3 |
急速凍結 | 装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 298 K / 詳細: 6 seconds |
-電子顕微鏡撮影
顕微鏡 | モデル: TFS TALOS |
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電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 200 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: DIFFRACTION / 最小 デフォーカス(公称値): 1500 nm / Cs: 2.7 mm / C2レンズ絞り径: 100 µm |
撮影 | 平均露光時間: 0.35 sec. / 電子線照射量: 50 e/Å2 フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k) 実像数: 1200 |
電子光学装置 | 位相板: VOLTA PHASE PLATE |
-解析
ソフトウェア | 名称: PHENIX / バージョン: 1.18.2_3874: / 分類: 精密化 | ||||||||||||||||||||||||
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EMソフトウェア |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||
3次元再構成 | 解像度: 3.2 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 120000 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 | プロトコル: OTHER | ||||||||||||||||||||||||
拘束条件 |
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