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- PDB-6i00: Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a cha... -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 6i00
タイトルCryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure.
要素Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
キーワードHYDROLASE / NITRILASE / Cyanide detoxification / Beta-cyano-L-alanine hydrolase / Helical filament
機能・相同性
機能・相同性情報


cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrilase activity / nitrile hydratase activity ...cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrilase activity / nitrile hydratase activity / plasma membrane / cytosol
類似検索 - 分子機能
Nitrilases / cyanide hydratase active site signature. / Nitrilase/Cyanide hydratase / Nitrilases / cyanide hydratase signature 1. / Nitrilase/cyanide hydratase, conserved site / Carbon-nitrogen hydrolase superfamily / Carbon-nitrogen hydrolase / Carbon-nitrogen hydrolase domain profile. / Carbon-nitrogen hydrolase
類似検索 - ドメイン・相同性
Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
類似検索 - 構成要素
生物種Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
手法電子顕微鏡法 / らせん対称体再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.4 Å
データ登録者Mulelu, A.E. / Woodward, J.D.
資金援助 南アフリカ, 英国, 2件
組織認可番号国
National Research Foundation in South AfricaResearch Career Advancement Fellowship 南アフリカ
Global Challenges Research FundStart: Synchrotron Techniques for African Research and Technology, ST/R002754/1 英国
引用ジャーナル: Commun Biol / 年: 2019
タイトル: Cryo-EM and directed evolution reveal how nitrilase specificity is influenced by its quaternary structure.
著者: Andani E Mulelu / Angela M Kirykowicz / Jeremy D Woodward /
要旨: Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced ...Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced nitrilases with altered specificity. Plant nitrilase substrate size and specificity correlate with helical twist, but molecular details of this relationship are lacking. Here we determine, to our knowledge, the first close-to-atomic resolution (3.4 Å) cryo-EM structure of an active helical nitrilase, the nitrilase 4 from . We apply site-saturation mutagenesis directed evolution to three residues (R95, S224, and L169) and generate a mutant with an altered helical twist that accepts substrates not catalyzed by known plant nitrilases. We reveal that a loop between α2 and α3 limits the length of the binding pocket and propose that it shifts position as a function of helical twist. These insights will allow us to start designing nitrilases for chemoenzymatic synthesis.
履歴
登録2018年10月24日登録サイト: PDBE / 処理サイト: PDBE
改定 1.02019年7月24日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12019年8月7日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / citation_author
Item: _citation.journal_volume / _citation.page_first ..._citation.journal_volume / _citation.page_first / _citation.page_last / _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title / _citation_author.identifier_ORCID
改定 1.22019年11月6日Group: Data collection / Refinement description / カテゴリ: em_3d_fitting / Item: _em_3d_fitting.target_criteria
改定 1.32019年12月18日Group: Other / カテゴリ: atom_sites
Item: _atom_sites.fract_transf_matrix[1][1] / _atom_sites.fract_transf_matrix[2][2] / _atom_sites.fract_transf_matrix[3][3]
改定 1.42024年5月15日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond / database_2
Item: _database_2.pdbx_DOI / _database_2.pdbx_database_accession

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構造の表示

ムービー
  • 登録構造単位
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • 単純化した表面モデル + あてはめた原子モデル
  • マップデータ: EMDB-0320
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • EMマップとの重ね合わせ
  • マップデータ: EMDB-0320
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
J: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
I: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
H: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
G: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
F: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
E: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
D: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
C: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
B: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
A: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
L: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
K: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)477,19312
ポリマ－477,19312
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
  • 根拠: microscopy
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
Buried area56940 Å2
ΔGint-291 kcal/mol
Surface area124920 Å2
手法PISA

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要素

#1: タンパク質
Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4 / Cyanoalanine nitrilase / Nitrilase 4


分子量: 39766.113 Da / 分子数: 12 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
遺伝子: NIT4, At5g22300, MWD9.8
発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
参照: UniProt: P46011, nitrilase, cyanoalanine nitrilase, 3-cyanoalanine hydratase

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: FILAMENT / ３次元再構成法: らせん対称体再構成法

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試料調製

構成要素名称: Active helical nitrilase complex / タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT
由来(天然)生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
緩衝液pH: 8
緩衝液成分
ID濃度名称式Buffer-ID
1200 mMSodium chlorideNaCl1
250 mMTrisTris-Hcl1
試料濃度: 0.15 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
試料支持グリッドの材料: GOLD / グリッドのサイズ: 400 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil, UltrAuFoil, R1.2/1.3
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK I / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 50 % / 凍結前の試料温度: 293 K
詳細: The sample (2.5 ul) was applied to the grid and incubated for 30 seconds at 50% humidity before blotting and plunging.

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2000 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 750 nm / Cs: 2.7 mm
試料ホルダ凍結剤: NITROGEN
試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER
撮影平均露光時間: 7 sec. / 電子線照射量: 45.5 e/Å2 / 検出モード: COUNTING
フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k)
撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 1266
画像スキャンサンプリングサイズ: 5 µm / 横: 3838 / 縦: 3710 / 動画フレーム数/画像: 45

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解析

EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ詳細
2EPU1.9.1画像取得
4Gctf1.06CTF補正
9RELION2初期オイラー角割当
10RELION2最終オイラー角割当
11RELION2分類RELION helical processing
12RELION2３次元再構成
13PHENIX1.14モデル精密化Real-space refine
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
らせん対称回転角度/サブユニット: -72.98 ° / 軸方向距離/サブユニット: 17.48 Å / らせん対称軸の対称性: C1
粒子像の選択選択した粒子像数: 392263
3次元再構成解像度: 3.4 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 133106 / クラス平均像の数: 67 / 対称性のタイプ: HELICAL
原子モデル構築プロトコル: AB INITIO MODEL / 空間: REAL / Target criteria: Cross-correlation coefficient
詳細: Ab initio fitting was performed using Buccaneer, cleaned up with Coot and Phenix Real-Space Refine.

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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