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- PDB-5m1s: Cryo-EM structure of the E. coli replicative DNA polymerase-clamp... -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 5m1s
タイトルCryo-EM structure of the E. coli replicative DNA polymerase-clamp-exonuclase-theta complex bound to DNA in the editing mode
要素
  • (DNA polymerase III subunit ...) x 4
  • DNA Primer Strand
  • DNA Template Strand
キーワードDNA BINDING PROTEIN / DNA editing Proofreading Exonuclease Polymerase
機能・相同性
機能・相同性情報


DNA polymerase III, core complex / DNA polymerase III complex / DNA replication proofreading / replisome / lagging strand elongation / exonuclease activity / leading strand elongation / 3'-5' exonuclease activity / DNA-templated DNA replication / DNA-directed DNA polymerase ...DNA polymerase III, core complex / DNA polymerase III complex / DNA replication proofreading / replisome / lagging strand elongation / exonuclease activity / leading strand elongation / 3'-5' exonuclease activity / DNA-templated DNA replication / DNA-directed DNA polymerase / DNA-directed DNA polymerase activity / ribosome / structural constituent of ribosome / ribonucleoprotein complex / translation / DNA binding / metal ion binding / cytosol / cytoplasm
類似検索 - 分子機能
DNA polymerase III-theta, bacterial / DNA polymerase III-theta superfamily / DNA polymerase III, theta subunit / : / : / DNA polymerase III subunit alpha, C-terminal domain / DNA polymerase 3, epsilon subunit / DNA polymerase III epsilon subunit, exonuclease domain / Bacterial DNA polymerase III alpha subunit, thumb domain / DNA polymerase III, alpha subunit ...DNA polymerase III-theta, bacterial / DNA polymerase III-theta superfamily / DNA polymerase III, theta subunit / : / : / DNA polymerase III subunit alpha, C-terminal domain / DNA polymerase 3, epsilon subunit / DNA polymerase III epsilon subunit, exonuclease domain / Bacterial DNA polymerase III alpha subunit, thumb domain / DNA polymerase III, alpha subunit / Bacterial DNA polymerase III, alpha subunit, NTPase domain / DNA polymerase, helix-hairpin-helix motif / DNA polymerase III alpha subunit finger domain / Bacterial DNA polymerase III alpha NTPase domain / Helix-hairpin-helix motif / Bacterial DNA polymerase III alpha subunit finger domain / PHP domain / PHP domain / Polymerase/histidinol phosphatase, N-terminal / DNA polymerase alpha chain like domain / Polymerase/histidinol phosphatase-like / DNA polymerase III beta subunit, N-terminal domain / DNA polymerase III beta subunit, central domain / DNA polymerase III beta subunit, C-terminal domain / Exonuclease / Exonuclease, RNase T/DNA polymerase III / EXOIII / OB-fold nucleic acid binding domain, AA-tRNA synthetase-type / OB-fold nucleic acid binding domain / Ribosomal protein L34, conserved site / Ribosomal protein L34 signature. / Ribosomal protein L34 / Ribosomal protein L34 / Ribonuclease H superfamily / Ribonuclease H-like superfamily / Nucleic acid-binding, OB-fold
類似検索 - ドメイン・相同性
DNA / DNA (> 10) / DNA polymerase III subunit epsilon / Large ribosomal subunit protein bL34 / DNA polymerase III subunit theta / DNA polymerase III subunit alpha
類似検索 - 構成要素
生物種Escherichia coli K12 (大腸菌)
synthetic construct (人工物)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 6.7 Å
データ登録者Fernandez-Leiro, R. / Conrad, J. / Scheres, S.H.W. / Lamers, M.H.
引用ジャーナル: Nat Struct Mol Biol / 年: 2017
タイトル: Self-correcting mismatches during high-fidelity DNA replication.
著者: Rafael Fernandez-Leiro / Julian Conrad / Ji-Chun Yang / Stefan M V Freund / Sjors H W Scheres / Meindert H Lamers /
要旨: Faithful DNA replication is essential to all forms of life and depends on the action of 3'-5' exonucleases that remove misincorporated nucleotides from the newly synthesized strand. However, how the ...Faithful DNA replication is essential to all forms of life and depends on the action of 3'-5' exonucleases that remove misincorporated nucleotides from the newly synthesized strand. However, how the DNA is transferred from the polymerase to the exonuclease active site is not known. Here we present the cryo-EM structure of the editing mode of the catalytic core of the Escherichia coli replisome, revealing a dramatic distortion of the DNA whereby the polymerase thumb domain acts as a wedge that separates the two DNA strands. Importantly, NMR analysis of the DNA substrate shows that the presence of a mismatch increases the fraying of the DNA, thus enabling it to reach the exonuclease active site. Therefore the mismatch corrects itself, whereas the exonuclease subunit plays a passive role. Hence, our work provides unique insights into high-fidelity replication and establishes a new paradigm for the correction of misincorporated nucleotides.
履歴
登録2016年10月10日登録サイト: PDBE / 処理サイト: PDBE
改定 1.02017年1月18日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12017年2月15日Group: Database references
改定 1.22017年8月30日Group: Data collection / Derived calculations / Experimental preparation
カテゴリ: em_imaging_optics / em_sample_support ...em_imaging_optics / em_sample_support / em_software / struct_conn
Item: _em_imaging_optics.energyfilter_name / _em_sample_support.grid_type ..._em_imaging_optics.energyfilter_name / _em_sample_support.grid_type / _em_software.details / _em_software.name
改定 1.32018年10月24日Group: Advisory / Data collection / Derived calculations
カテゴリ: pdbx_validate_close_contact / struct_conn / struct_conn_type
改定 1.42024年5月15日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond / database_2
Item: _database_2.pdbx_DOI / _database_2.pdbx_database_accession

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構造の表示

ムービー
  • 登録構造単位
  • Jmolによる作画
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  • EMマップとの重ね合わせ
  • マップデータ: EMDB-4141
  • UCSF Chimeraによる作画
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ムービービューア
構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: DNA polymerase III subunit alpha
B: DNA polymerase III subunit beta
C: DNA polymerase III subunit beta
D: DNA polymerase III subunit epsilon
P: DNA Primer Strand
T: DNA Template Strand
F: DNA polymerase III subunit theta


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)230,4327
ポリマ－230,4327
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
Buried area16940 Å2
ΔGint-84 kcal/mol
Surface area91740 Å2
手法PISA

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要素

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DNA polymerase III subunit ... , 4種, 5分子 ABCDF

#1: タンパク質 DNA polymerase III subunit alpha


分子量: 103554.422 Da / 分子数: 1 / 変異: A921L, M923L / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia coli K12 (大腸菌) / 遺伝子: dnaE, polC, b0184, JW0179 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: P10443, DNA-directed DNA polymerase
#2: タンパク質 DNA polymerase III subunit beta / Beta sliding clamp / Beta clamp


分子量: 40630.508 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia coli K12 (大腸菌) / 遺伝子: dnaN, b3701, JW3678 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: P0A988, DNA-directed DNA polymerase
#3: タンパク質 DNA polymerase III subunit epsilon


分子量: 27118.984 Da / 分子数: 1 / 変異: T183L M185L A186P F187L / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia coli K12 (大腸菌) / 遺伝子: dnaQ, mutD, b0215, JW0205 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: P03007, DNA-directed DNA polymerase
#6: タンパク質 DNA polymerase III subunit theta


分子量: 6503.385 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia coli K12 (大腸菌) / 遺伝子: holE, b1842, JW1831 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: P0ABS8, DNA-directed DNA polymerase

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DNA鎖 , 2種, 2分子 PT

#4: DNA鎖 DNA Primer Strand


分子量: 5275.448 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) synthetic construct (人工物) / 発現宿主: synthetic construct (人工物)
#5: DNA鎖 DNA Template Strand


分子量: 6718.339 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) synthetic construct (人工物) / 発現宿主: synthetic construct (人工物)

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来詳細
1DNA polymerase III alpha, beta, epsilon, theta complex with mismatched DNA duplexCOMPLEXall0MULTIPLE SOURCES
2DNA polymerase III alpha, beta, epsilon, theta complex with mismatched DNA duplexCOMPLEX#1-#3, #61RECOMBINANTMap obtained after signal subtraction of the beta subunit and alignment of the remaining parts. Final reconstruction obtained with non-subtracted images and angles from local alignment
3mismatched DNA duplexCOMPLEX#4-#51RECOMBINANT
分子量
IDEntity assembly-ID値 (°)実験値
110.250 MDaNO
12
13
由来(天然)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID株
11Escherichia coli K12 (大腸菌)83333K12
22Escherichia coli K12 (大腸菌)83333K12
33synthetic construct (人工物)32630
由来(組換発現)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID株プラスミド
11Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)469008BL21(DE3)pET28a
22Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)469008BL21(DE3)pET28a
33synthetic construct (人工物)32630
緩衝液pH: 7.5
緩衝液成分
ID濃度名称Buffer-ID
120 mMHepes1
250 mMPotassium glutamate1
35 mMMagnesium Acetate1
42 mMDithiothreitol1
試料濃度: 0.25 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
詳細: Sample was run over a gel filtration column prior to vitrification
試料支持グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 300 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 277 K
詳細: Prior to sample preparation 0.1 volumes of 0.05% Tween 20 were added to the sample 3 microliters were pipetted onto the grid and blotted for 4 seconds

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 倍率（公称値）: 64000 X / 倍率（補正後）: 79545 X / 最大 デフォーカス（公称値）: 3500 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1800 nm / Cs: 2.7 mm / C2レンズ絞り径: 50 µm / アライメント法: COMA FREE
試料ホルダ凍結剤: NITROGEN
試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER
最高温度: 80 K / 最低温度: 80 K
撮影平均露光時間: 25 sec. / 電子線照射量: 2 e/Å2 / 検出モード: COUNTING
フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k)
撮影したグリッド数: 3 / 実像数: 1157
電子光学装置エネルギーフィルター名称: GIF Quantum / エネルギーフィルター 上限: 20 eV / エネルギーフィルター 下限: 0 eV
画像スキャン横: 3710 / 縦: 3710 / 動画フレーム数/画像: 20 / 利用したフレーム数/画像: 1-20

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解析

EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ詳細
1RELION2粒子像選択
2DigitalMicrograph2.3画像取得Manual collection
3Titan User Interface画像取得Low dose
5GctfCTF補正
8Coot0.8.2モデルフィッティング
10RELION2初期オイラー角割当
11RELION2最終オイラー角割当
12RELION2分類
13RELION2３次元再構成
14REFMAC5.8モデル精密化
15LIBGモデル精密化
CTF補正タイプ: NONE
粒子像の選択選択した粒子像数: 150000
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 6.7 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 15616 / アルゴリズム: FOURIER SPACE / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築プロトコル: OTHER
詳細: The cryo-EM structure of the PolIIIalpha-clamp-exonuclease complex in the polymerase mode (PDB code: 5FKW) was used as a starting model, and the NMR structure of theta bound to the ...詳細: The cryo-EM structure of the PolIIIalpha-clamp-exonuclease complex in the polymerase mode (PDB code: 5FKW) was used as a starting model, and the NMR structure of theta bound to the exonuclease catalytic domain (PDB code: 2XY8) was used to place theta into the cryo-EM map. The model was manually adjusted in Coot and geometry of the protein optimized in Refmac5 using DNA-specific restraints generated in LibG

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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