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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 6u20 | |||||||||||||||||||||||||||
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タイトル | AAV8 human HEK293-produced, empty capsid | |||||||||||||||||||||||||||
要素 | Capsid protein | |||||||||||||||||||||||||||
キーワード | VIRUS / Adeno-associated virus / AAV / gene therapy vector / post translational modification / capsid | |||||||||||||||||||||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 | |||||||||||||||||||||||||||
生物種 | Adeno-associated virus - 8 (アデノ随伴ウイルス) | |||||||||||||||||||||||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.3 Å | |||||||||||||||||||||||||||
データ登録者 | Paulk, N.K. / Poweleit, N. | |||||||||||||||||||||||||||
資金援助 | 米国, 8件
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引用 | ジャーナル: Mol Ther Methods Clin Dev / 年: 2020 タイトル: Methods Matter: Standard Production Platforms for Recombinant AAV Produce Chemically and Functionally Distinct Vectors. 著者: Neil G Rumachik / Stacy A Malaker / Nicole Poweleit / Lucy H Maynard / Christopher M Adams / Ryan D Leib / Giana Cirolia / Dennis Thomas / Susan Stamnes / Kathleen Holt / Patrick Sinn / ...著者: Neil G Rumachik / Stacy A Malaker / Nicole Poweleit / Lucy H Maynard / Christopher M Adams / Ryan D Leib / Giana Cirolia / Dennis Thomas / Susan Stamnes / Kathleen Holt / Patrick Sinn / Andrew P May / Nicole K Paulk / 要旨: Different approaches are used in the production of recombinant adeno-associated virus (rAAV). The two leading approaches are transiently transfected human HEK293 cells and live baculovirus infection ...Different approaches are used in the production of recombinant adeno-associated virus (rAAV). The two leading approaches are transiently transfected human HEK293 cells and live baculovirus infection of () insect cells. Unexplained differences in vector performance have been seen clinically and preclinically. Thus, we performed a controlled comparative production analysis varying only the host cell species but maintaining all other parameters. We characterized differences with multiple analytical approaches: proteomic profiling by mass spectrometry, isoelectric focusing, cryo-EM (transmission electron cryomicroscopy), denaturation assays, genomic and epigenomic sequencing of packaged genomes, human cytokine profiling, and functional transduction assessments and , including in humanized liver mice. Using these approaches, we have made two major discoveries: (1) rAAV capsids have post-translational modifications (PTMs), including glycosylation, acetylation, phosphorylation, and methylation, and these differ between platforms; and (2) rAAV genomes are methylated during production, and these are also differentially deposited between platforms. Our data show that host cell protein impurities differ between platforms and can have their own PTMs, including potentially immunogenic N-linked glycans. Human-produced rAAVs are more potent than baculovirus- vectors in various cell types (p < 0.05-0.0001), in various mouse tissues (p < 0.03-0.0001), and in human liver (p < 0.005). These differences may have clinical implications for rAAV receptor binding, trafficking, expression kinetics, expression durability, vector immunogenicity, as well as cost considerations. | |||||||||||||||||||||||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 6u20.cif.gz | 107.4 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb6u20.ent.gz | 80.9 KB | 表示 | PDB形式 |
PDBx/mmJSON形式 | 6u20.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 6u20_validation.pdf.gz | 1.2 MB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 6u20_full_validation.pdf.gz | 1.2 MB | 表示 | |
XML形式データ | 6u20_validation.xml.gz | 40 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 6u20_validation.cif.gz | 56.7 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/u2/6u20 ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/u2/6u20 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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| x 60
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| x 5
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| x 6
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対称性 | 点対称性: (シェーンフリース記号: I (正20面体型対称)) |
-要素
#1: タンパク質 | 分子量: 58528.367 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Adeno-associated virus - 8 (アデノ随伴ウイルス) 発現宿主: Homo sapiens (ヒト) / 参照: UniProt: Q8JQF8 |
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-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 | 名称: Adeno-associated virus - 8 / タイプ: VIRUS 詳細: Recombinant AAV8 vector, produced in adherent human HEK293 cells purchased from ATCC. Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT | ||||||||||||||||||||||||||||||
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由来(天然) | 生物種: Adeno-associated virus - 8 (アデノ随伴ウイルス) | ||||||||||||||||||||||||||||||
由来(組換発現) | 生物種: Homo sapiens (ヒト) / 細胞: HEK293 | ||||||||||||||||||||||||||||||
ウイルスについての詳細 | 中空か: YES / エンベロープを持つか: NO / 単離: SEROTYPE / タイプ: VIRION | ||||||||||||||||||||||||||||||
緩衝液 | pH: 7.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||
緩衝液成分 |
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試料 | 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES | ||||||||||||||||||||||||||||||
急速凍結 | 装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE |
-電子顕微鏡撮影
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD |
試料ホルダ | 凍結剤: NITROGEN 試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER |
撮影 | 平均露光時間: 6 sec. / 電子線照射量: 66 e/Å2 / 検出モード: COUNTING フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k) 実像数: 1647 |
画像スキャン | 動画フレーム数/画像: 30 |
-解析
ソフトウェア | 名称: PHENIX / バージョン: 1.14_3260: / 分類: 精密化 | ||||||||||||||||||||||||||||||
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EMソフトウェア |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||||||||
対称性 | 点対称性: I (正20面体型対称) | ||||||||||||||||||||||||||||||
3次元再構成 | 解像度: 3.3 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 15107 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 | プロトコル: RIGID BODY FIT / 空間: REAL |