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万見
- PDB-5y36: Cryo-EM structure of SpCas9-sgRNA-DNA ternary complex -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 5y36
タイトルCryo-EM structure of SpCas9-sgRNA-DNA ternary complex
要素
  • CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
  • complementary DNA strand
  • non-complementary DNA strand
  • single-guide RNA
キーワードHYDROLASE/RNA/DNA / Genome editting / CRIPSR-Cas9 / DNA cleavage mechanism / HYDROLASE-DNA-RNA complex / HYDROLASE-RNA-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. ...CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
デオキシリボ核酸 / DNA (> 10) / リボ核酸 / RNA (> 10) / CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
類似検索 - 構成要素
生物種Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
Mus musculus (ハツカネズミ)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 5.2 Å
データ登録者Huang, Q. / Li, G. / Huai, C.
資金援助 中国, 2件
組織認可番号国
The Natural Science Foundation of China91430112 中国
The Shanghai Natural Science Foundation13ZR1402400 中国
引用ジャーナル: Nat Commun / 年: 2017
タイトル: Structural insights into DNA cleavage activation of CRISPR-Cas9 system.
著者: Cong Huai / Gan Li / Ruijie Yao / Yingyi Zhang / Mi Cao / Liangliang Kong / Chenqiang Jia / Hui Yuan / Hongyan Chen / Daru Lu / Qiang Huang /
要旨: CRISPR-Cas9 technology has been widely used for genome engineering. Its RNA-guided endonuclease Cas9 binds specifically to target DNA and then cleaves the two DNA strands with HNH and RuvC nuclease ...CRISPR-Cas9 technology has been widely used for genome engineering. Its RNA-guided endonuclease Cas9 binds specifically to target DNA and then cleaves the two DNA strands with HNH and RuvC nuclease domains. However, structural information regarding the DNA cleavage-activating state of two nuclease domains remains sparse. Here, we report a 5.2 Å cryo-EM structure of Cas9 in complex with sgRNA and target DNA. This structure reveals a conformational state of Cas9 in which the HNH domain is closest to the DNA cleavage site. Compared with two known HNH states, our structure shows that the HNH active site moves toward the cleavage site by about 25 and 13 Å, respectively. In combination with EM-based molecular dynamics simulations, we show that residues of the nuclease domains in our structure could form cleavage-compatible conformations with the target DNA. Together, these results strongly suggest that our cryo-EM structure resembles a DNA cleavage-activating architecture of Cas9.
履歴
登録2017年7月27日登録サイト: PDBJ / 処理サイト: PDBJ
改定 1.02017年12月6日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12024年3月27日Group: Data collection / Database references ...Data collection / Database references / Derived calculations / Refinement description
カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond ...chem_comp_atom / chem_comp_bond / database_2 / em_3d_fitting_list / pdbx_initial_refinement_model / struct_conn
Item: _database_2.pdbx_DOI / _database_2.pdbx_database_accession ..._database_2.pdbx_DOI / _database_2.pdbx_database_accession / _em_3d_fitting_list.accession_code / _em_3d_fitting_list.initial_refinement_model_id / _em_3d_fitting_list.source_name / _em_3d_fitting_list.type / _struct_conn.pdbx_dist_value / _struct_conn.ptnr1_auth_asym_id / _struct_conn.ptnr1_auth_comp_id / _struct_conn.ptnr1_auth_seq_id / _struct_conn.ptnr1_label_asym_id / _struct_conn.ptnr1_label_atom_id / _struct_conn.ptnr1_label_comp_id / _struct_conn.ptnr1_label_seq_id / _struct_conn.ptnr2_auth_asym_id / _struct_conn.ptnr2_auth_comp_id / _struct_conn.ptnr2_auth_seq_id / _struct_conn.ptnr2_label_asym_id / _struct_conn.ptnr2_label_atom_id / _struct_conn.ptnr2_label_comp_id / _struct_conn.ptnr2_label_seq_id

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構造の表示

ムービー
  • 登録構造単位
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • EMマップとの重ね合わせ
  • マップデータ: EMDB-8236
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
B: single-guide RNA
C: complementary DNA strand
D: non-complementary DNA strand
ヘテロ分子


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)215,7967
ポリマ－215,7234
非ポリマー733
水0
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者が定義した集合体
  • 根拠: native gel electrophoresis
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
Buried area26400 Å2
ΔGint-214 kcal/mol
Surface area98820 Å2

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要素

#1: タンパク質 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 / SpCas9 / SpyCas9


分子量: 158588.781 Da / 分子数: 1 / 変異: D10A, H840A / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
遺伝子: cas9, csn1, SPy_1046 / プラスミド: pET28a
発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
参照: UniProt: Q99ZW2, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素
#2: RNA鎖 single-guide RNA


分子量: 31890.916 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Mus musculus (ハツカネズミ)
#3: DNA鎖 complementary DNA strand


分子量: 12697.152 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Mus musculus (ハツカネズミ)
#4: DNA鎖 non-complementary DNA strand


分子量: 12546.073 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Mus musculus (ハツカネズミ)
#5: 化合物 ChemComp-MG / MAGNESIUM ION / マグネシウムジカチオン


分子量: 24.305 Da / 分子数: 3 / 由来タイプ: 合成 / 式: Mg

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来詳細
1SpCas9-sgRNA-target DNA complexCOMPLEX#1-#40MULTIPLE SOURCES
2SpCas9ORGANELLE OR CELLULAR COMPONENT#11RECOMBINANTCas9 protein from Streptococcus pyogenes
3single-guide RNACOMPLEX#21MULTIPLE SOURCES99 mer RNA that guide Cas9 protein to recognize and bind to target DNA
4Target DNACOMPLEX#3-#41MULTIPLE SOURCESTarget DNA for Cas9-sgRNA binding
分子量
IDEntity assembly-ID値 (°)実験値
110.225 MDaNO
210.1588 MDaNO
3132.46 kDa/nmNO
4133.864 kDa/nmNO
由来(天然)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
21Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)301447
32Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)301447
43Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)301447
54Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)301447
由来(組換発現)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
21Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)866768
32Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)866768
43Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)866768
54Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)866768
緩衝液pH: 7.5
詳細: 20mM Tris-Cl (pH 7.5), 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT
緩衝液成分
ID濃度名称式Buffer-ID
120 mmol/Ltrihydroxymethyl aminomethaneTrisトリスヒドロキシメチルアミノメタン1
2100 mmol/Lpotassium chlorideKCl1
35 mmol/Lmagnesium chlorideMgCl21
41 mmol/LdithiothreitolジチオトレイトールDTT1
試料濃度: 0.45 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
詳細: dCas9 protein and sgRNA, DNA were cultured at 37 degree centigrade to form a complex, and then monodisperased at 18 degree centigrade overnight.
試料支持グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 200 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 289 K / 詳細: blot for 4 seconds before pluging

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELDBright-field microscopy / 倍率（補正後）: 18000 X / 最小 デフォーカス（公称値）: 1300 nm / 最大 デフォーカス（補正後）: 3500 nm
試料ホルダ凍結剤: NITROGEN
試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER
撮影電子線照射量: 10 e/Å2
フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k)
実像数: 592
画像スキャン横: 3710 / 縦: 3838 / 動画フレーム数/画像: 38

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解析

EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ
1RELION1.3粒子像選択
2RELION1.3画像取得
4CTFFIND33CTF補正
7NAMD2.1モデルフィッティング
9Rosetta3.5モデル精密化
10RELION1.3初期オイラー角割当
11RELION1.3最終オイラー角割当
12RELION1.3分類
13RELION1.3３次元再構成
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING ONLY
粒子像の選択選択した粒子像数: 66845
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 5.2 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 57484 / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築B value: 80 / プロトコル: FLEXIBLE FIT / 空間: REAL / Target criteria: Correlation coefficient
原子モデル構築PDB-ID: 4OO8

4oo8


PDB chain-ID: A / Accession code: 4OO8 / Pdb chain residue range: 1-1368 / Source name: PDB / タイプ: experimental model

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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