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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-8749 | |||||||||
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タイトル | cryo-EM structure of the Cas9-sgRNA-AcrIIA4 anti-CRISPR complex | |||||||||
マップデータ | Cas9- sgRNA-AcrIIA4 anti-CRISPR complex | |||||||||
試料 |
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キーワード | anti-CRISPR / Cas9 / CRISPR / gene editing / on-target / off-target / cryo-EM / Immune System-RNA complex | |||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 symbiont-mediated suppression of host CRISPR-cas system / maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | |||||||||
生物種 | Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) / unidentified phage (ファージ) | |||||||||
手法 | 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.9 Å | |||||||||
データ登録者 | Jiang F / Liu JJ | |||||||||
資金援助 | 米国, 1件
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引用 | ジャーナル: Sci Adv / 年: 2017 タイトル: Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. 著者: Jiyung Shin / Fuguo Jiang / Jun-Jie Liu / Nicolas L Bray / Benjamin J Rauch / Seung Hyun Baik / Eva Nogales / Joseph Bondy-Denomy / Jacob E Corn / Jennifer A Doudna / 要旨: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 gene editing technology is derived from a microbial adaptive immune system, where bacteriophages are often the intended target. ...CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 gene editing technology is derived from a microbial adaptive immune system, where bacteriophages are often the intended target. Natural inhibitors of CRISPR-Cas9 enable phages to evade immunity and show promise in controlling Cas9-mediated gene editing in human cells. However, the mechanism of CRISPR-Cas9 inhibition is not known, and the potential applications for Cas9 inhibitor proteins in mammalian cells have not been fully established. We show that the anti-CRISPR protein AcrIIA4 binds only to assembled Cas9-single-guide RNA (sgRNA) complexes and not to Cas9 protein alone. A 3.9 Å resolution cryo-electron microscopy structure of the Cas9-sgRNA-AcrIIA4 complex revealed that the surface of AcrIIA4 is highly acidic and binds with a 1:1 stoichiometry to a region of Cas9 that normally engages the DNA protospacer adjacent motif. Consistent with this binding mode, order-of-addition experiments showed that AcrIIA4 interferes with DNA recognition but has no effect on preformed Cas9-sgRNA-DNA complexes. Timed delivery of AcrIIA4 into human cells as either protein or expression plasmid allows on-target Cas9-mediated gene editing while reducing off-target edits. These results provide a mechanistic understanding of AcrIIA4 function and demonstrate that inhibitors can modulate the extent and outcomes of Cas9-mediated gene editing. | |||||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | EMマップ: SurfViewMolmilJmol/JSmol |
添付画像 |
-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_8749.map.gz | 5 MB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-8749-v30.xml emd-8749.xml | 15.4 KB 15.4 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
画像 | emd_8749.png | 120 KB | ||
Filedesc metadata | emd-8749.cif.gz | 6.7 KB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-8749 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-8749 | HTTPS FTP |
-検証レポート
文書・要旨 | emd_8749_validation.pdf.gz | 365.9 KB | 表示 | EMDB検証レポート |
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文書・詳細版 | emd_8749_full_validation.pdf.gz | 365.5 KB | 表示 | |
XML形式データ | emd_8749_validation.xml.gz | 6.1 KB | 表示 | |
CIF形式データ | emd_8749_validation.cif.gz | 6.9 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-8749 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-8749 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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「今月の分子」の関連する項目 |
-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_8749.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 64 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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注釈 | Cas9- sgRNA-AcrIIA4 anti-CRISPR complex | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 1.07 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
CCP4マップ ヘッダ情報:
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-添付データ
-試料の構成要素
-全体 : the complex of Streptococcus progenies Cas9 with sgRNA and AcrIIA4
全体 | 名称: the complex of Streptococcus progenies Cas9 with sgRNA and AcrIIA4 |
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要素 |
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-超分子 #1: the complex of Streptococcus progenies Cas9 with sgRNA and AcrIIA4
超分子 | 名称: the complex of Streptococcus progenies Cas9 with sgRNA and AcrIIA4 タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) |
-超分子 #2: Streptococcus pyogenes M1 GAS
超分子 | 名称: Streptococcus pyogenes M1 GAS / タイプ: complex / ID: 2 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #1-#2 |
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由来(天然) | 生物種: unidentified phage (ファージ) |
-超分子 #3: unidentified phage
超分子 | 名称: unidentified phage / タイプ: complex / ID: 3 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #3 |
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-分子 #1: single guide RNA (116-MER)
分子 | 名称: single guide RNA (116-MER) / タイプ: rna / ID: 1 / コピー数: 1 |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) |
分子量 | 理論値: 38.292645 KDa |
配列 | 文字列: (GTP)GCGCAUAAA GAUGAGACGC GUUUUAGAGC UAUGCUGUUU UGAAAAAAAC AGCAUAGCAA GUUAAAAUAA GGCUAG UCC GUUAUCAACU UGAAAAAGUG GCACCGAGUC GGUGCUUCG |
-分子 #2: CRISPR-associated endonuclease Cas9
分子 | 名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 2 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO EC番号: 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) |
分子量 | 理論値: 158.772891 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
配列 | 文字列: SMDKKYSIGL DIGTNSVGWA VITDDYKVPS KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSN EMAKVDDSFF HRLEESFLVE EDKKHERHPI FGNIVDEVAY HEKYPTIYHL RKKLVDSTDK ADLRLIYLAL A HMIKFRGH ...文字列: SMDKKYSIGL DIGTNSVGWA VITDDYKVPS KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSN EMAKVDDSFF HRLEESFLVE EDKKHERHPI FGNIVDEVAY HEKYPTIYHL RKKLVDSTDK ADLRLIYLAL A HMIKFRGH FLIEGDLNPD NSDVDKLFIQ LVQTYNQLFE ENPINASGVD AKAILSARLS KSRRLENLIA QLPGEKKNGL FG NLIALSL GLTPNFKSNF DLAEDAKLQL SKDTYDDDLD NLLAQIGDQY ADLFLAAKNL SDAILLSDIL RVNTEITKAP LSA SMIKRY DEHHQDLTLL KALVRQQLPE KYKEIFFDQS KNGYAGYIDG GASQEEFYKF IKPILEKMDG TEELLVKLNR EDLL RKQRT FDNGSIPHQI HLGELHAILR RQEDFYPFLK DNREKIEKIL TFRIPYYVGP LARGNSRFAW MTRKSEETIT PWNFE EVVD KGASAQSFIE RMTNFDKNLP NEKVLPKHSL LYEYFTVYNE LTKVKYVTEG MRKPAFLSGE QKKAIVDLLF KTNRKV TVK QLKEDYFKKI ECFDSVEISG VEDRFNASLG TYHDLLKIIK DKDFLDNEEN EDILEDIVLT LTLFEDREMI EERLKTY AH LFDDKVMKQL KRRRYTGWGR LSRKLINGIR DKQSGKTILD FLKSDGFANR NFMQLIHDDS LTFKEDIQKA QVSGQGDS L HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER MKRIEEGIKE LGSQILKEH PVENTQLQNE KLYLYYLQNG RDMYVDQELD INRLSDYDVD HIVPQSFLKD DSIDNKVLTR SDKNRGKSDN VPSEEVVKKM KNYWRQLLN AKLITQRKFD NLTKAERGGL SELDKAGFIK RQLVETRQIT KHVAQILDSR MNTKYDENDK LIREVKVITL K SKLVSDFR KDFQFYKVRE INNYHHAHDA YLNAVVGTAL IKKYPKLESE FVYGDYKVYD VRKMIAKSEQ EIGKATAKYF FY SNIMNFF KTEITLANGE IRKRPLIETN GETGEIVWDK GRDFATVRKV LSMPQVNIVK KTEVQTGGFS KESILPKRNS DKL IARKKD WDPKKYGGFD SPTVAYSVLV VAKVEKGKSK KLKSVKELLG ITIMERSSFE KNPIDFLEAK GYKEVKKDLI IKLP KYSLF ELENGRKRML ASAGELQKGN ELALPSKYVN FLYLASHYEK LKGSPEDNEQ KQLFVEQHKH YLDEIIEQIS EFSKR VILA DANLDKVLSA YNKHRDKPIR EQAENIIHLF TLTNLGAPAA FKYFDTTIDR KRYTSTKEVL DATLIHQSIT GLYETR IDL SQLGGD UniProtKB: UNIPROTKB: A0A0C6FZC2 |
-分子 #3: phage anti-CRISPR AcrIIA4
分子 | 名称: phage anti-CRISPR AcrIIA4 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 3 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO |
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由来(天然) | 生物種: unidentified phage (ファージ) |
分子量 | 理論値: 10.182073 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
配列 | 文字列: MNINDLIREI KNKDYTVKLS GTDSNSITQL IIRVNNDGNE YVISESENES IVEKFISAFK NGWNQEYEDE EEFYNDMQTI TLKSELN |
-実験情報
-構造解析
手法 | クライオ電子顕微鏡法 |
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解析 | 単粒子再構成法 |
試料の集合状態 | particle |
-試料調製
濃度 | 1.25 mg/mL |
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緩衝液 | pH: 8 |
グリッド | モデル: C-flat-2/2 / 材質: COPPER / メッシュ: 400 / 支持フィルム - トポロジー: HOLEY / 前処理 - タイプ: PLASMA CLEANING / 前処理 - 時間: 12 sec. |
凍結 | 凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 281 K / 装置: FEI VITROBOT MARK IV 詳細: blot for 4.5 seconds with force of 12 before plunging. |
詳細 | spyCas9, sgRNA and AcrIIA4 complex |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | FEI TITAN KRIOS |
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撮影 | フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k) 検出モード: SUPER-RESOLUTION / 平均電子線量: 46.0 e/Å2 |
電子線 | 加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | C2レンズ絞り径: 100.0 µm / 最大 デフォーカス(補正後): 4.0 µm / 最小 デフォーカス(補正後): 0.9 µm / 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 0.01 mm / 最大 デフォーカス(公称値): 3.0 µm / 最小 デフォーカス(公称値): 1.0 µm |
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
-画像解析
初期モデル | モデルのタイプ: EMDB MAP EMDB ID: |
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最終 再構成 | 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 3.9 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 185000 |
初期 角度割当 | タイプ: ANGULAR RECONSTITUTION |
最終 角度割当 | タイプ: ANGULAR RECONSTITUTION / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 2.0) |
-原子モデル構築 1
精密化 | 空間: REAL / プロトコル: AB INITIO MODEL |
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得られたモデル | PDB-5vzl: |
-原子モデル構築 2
精密化 | 空間: REAL / プロトコル: RIGID BODY FIT |
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得られたモデル | PDB-5vzl: |