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万見
- EMDB-4406: Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a cha... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-4406
タイトルCryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure.
マップデータAtNIT4 R95T L169A S224Q filament
試料
  • 複合体: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant
    • タンパク質・ペプチド: NITRILASE 4 mutant
生物種Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
手法らせん対称体再構成法 / ネガティブ染色法 / 解像度: 20.0 Å
データ登録者Mulelu AE / Woodward JD
資金援助 南アフリカ, 1件
OrganizationGrant number国
National Research Foundation in South AfricaResearch Career Advancement Fellowship 南アフリカ
引用ジャーナル: Commun Biol / 年: 2019
タイトル: Cryo-EM and directed evolution reveal how nitrilase specificity is influenced by its quaternary structure.
著者: Andani E Mulelu / Angela M Kirykowicz / Jeremy D Woodward /
要旨: Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced ...Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced nitrilases with altered specificity. Plant nitrilase substrate size and specificity correlate with helical twist, but molecular details of this relationship are lacking. Here we determine, to our knowledge, the first close-to-atomic resolution (3.4 Å) cryo-EM structure of an active helical nitrilase, the nitrilase 4 from . We apply site-saturation mutagenesis directed evolution to three residues (R95, S224, and L169) and generate a mutant with an altered helical twist that accepts substrates not catalyzed by known plant nitrilases. We reveal that a loop between α2 and α3 limits the length of the binding pocket and propose that it shifts position as a function of helical twist. These insights will allow us to start designing nitrilases for chemoenzymatic synthesis.
履歴
登録2018年11月8日-
ヘッダ(付随情報) 公開2019年8月7日-
マップ公開2019年8月7日-
更新2019年8月7日-
現状2019年8月7日処理サイト: PDBe / 状態: 公開

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構造の表示

ムービー
  • 表面図（断面を密度値に従い着色）
  • 表面レベル: 2
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • 表面図（円筒半径に従い着色）
  • 表面レベル: 2
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューアEMマップ:
SurfViewMolmilJmol/JSmol
添付画像

emd_4406.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_4406.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 2 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
注釈AtNIT4 R95T L169A S224Q filament
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
4.11 Å/pix.
x 80 pix.
= 328.8 Å		4.11 Å/pix.
x 80 pix.
= 328.8 Å		4.11 Å/pix.
x 80 pix.
= 328.8 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 4.11 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 2.0 / ムービー #1: 2
最小 - 最大-2.5709467 - 4.9610124
平均 (標準偏差)0.000000004074297 (±1.0)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin-40-40-40
サイズ808080
Spacing808080
セルA=B=C: 328.80002 Å
α=β=γ: 90.0 °

CCP4マップ ヘッダ情報:

modeImage stored as Reals
Å/pix. X/Y/Z4.114.114.11
M x/y/z808080
origin x/y/z0.0000.0000.000
length x/y/z328.800328.800328.800
α/β/γ90.00090.00090.000
start NX/NY/NZ-15-9-23
NX/NY/NZ635180
MAP C/R/S123
start NC/NR/NS-40-40-40
NC/NR/NS808080
D min/max/mean-2.5714.9610.000

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添付データ

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試料の構成要素

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全体 : Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant

全体名称: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant
要素
  • 複合体: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant
    • タンパク質・ペプチド: NITRILASE 4 mutant

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超分子 #1: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant

超分子名称: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 mutant / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all / 詳細: Generated by directed evolution
由来(天然)生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換プラスミド: pET-21b(+)
分子量実験値: 400 KDa

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分子 #1: NITRILASE 4 mutant

分子名称: NITRILASE 4 mutant / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / 光学異性体: LEVO / EC番号: nitrilase
由来(天然)生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
配列文字列: MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFEL AIGSTTAKGR DDFRKYHASA IDVPGPEVER LALMAKKYKV YLVMGVIERE GYTLYCTVLF FDSQGLFLGK HRKLMPTAAE ...文字列:
MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFEL AIGSTTAKGR DDFRKYHASA IDVPGPEVER LALMAKKYKV YLVMGVIERE GYTLYCTVLF FDSQGLFLGK HRKLMPTAAE RCIWGFGDGS TIPVFDTPIG KIGAAICWEN RMPSLRTAMY AKGIEIYCAP TADQRETWLA SMTHIALEGG CFVLSANQFC RRKDYPSPPE YMFSGSEESL TPDSVVCAGG SSIISPLGIV LAGPNYRGEA LITADLDLGD IARAKFDFDV VGHYSRPEVF SLNIREHPRK AVSFKTSKVM EDESVHHHHH H

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実験情報

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構造解析

手法ネガティブ染色法
解析らせん対称体再構成法
試料の集合状態filament

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試料調製

濃度0.3 mg/mL
緩衝液pH: 8
構成要素:
濃度式名称
50.0 mMTris-HclTris
200.0 mMNaClsodium chloride
染色タイプ: NEGATIVE / 材質: Uranyl acetate
グリッドモデル: Homemade / 材質: COPPER / メッシュ: 400 / 支持フィルム - 材質: CARBON / 支持フィルム - トポロジー: CONTINUOUS / 支持フィルム - Film thickness: 15.0 nm / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE / 前処理 - 雰囲気: AIR

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TECNAI 20
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN ULTRASCAN 4000 (4k x 4k)
撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 50 / 平均露光時間: 1.0 sec. / 平均電子線量: 10.0 e/Å2
電子線加速電圧: 200 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.1 mm / 最大 デフォーカス（公称値）: 0.5 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.5 µm / 倍率（公称値）: 50000
試料ステージ試料ホルダーモデル: PHILIPS ROTATION HOLDER

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画像解析

詳細The images were low-pass filtered to 20 A and normalised.
最終 再構成使用したクラス数: 90
想定した対称性 - らせんパラメータ - Δz: 14.52459 Å
想定した対称性 - らせんパラメータ - ΔΦ: -65.59083 °
想定した対称性 - らせんパラメータ - 軸対称性: C2 (2回回転対称)
アルゴリズム: BACK PROJECTION / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 20.0 Å / 解像度の算出法: FSC 0.5 CUT-OFF / ソフトウェア - 名称: SPIDER (ver. 21.10) / ソフトウェア - 詳細: IHRSR / 使用した粒子像数: 10000
Segment selection選択した数: 10000 / ソフトウェア - 名称: EMAN
ソフトウェア - 詳細: Boxer was used in helical mode with 95% overlap
初期モデルモデルのタイプ: INSILICO MODEL / In silico モデル: Featureless cylinder
最終 角度割当タイプ: NOT APPLICABLE / ソフトウェア - 名称: SPIDER (ver. 21.10) / ソフトウェア - 詳細: IHRSR

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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