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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-4407 | |||||||||
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タイトル | Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure. | |||||||||
マップデータ | Synechocystis sp. PCC6803 (BAA10717.1) nitrilase truncated at residue 291 | |||||||||
試料 |
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生物種 | Synechocystis sp. PCC 6803 (バクテリア) | |||||||||
手法 | らせん対称体再構成法 / ネガティブ染色法 / 解像度: 20.0 Å | |||||||||
データ登録者 | Yamkela Q / Mulelu AE / Woodward JD | |||||||||
資金援助 | 南アフリカ, 1件
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引用 | ジャーナル: Commun Biol / 年: 2019 タイトル: Cryo-EM and directed evolution reveal how nitrilase specificity is influenced by its quaternary structure. 著者: Andani E Mulelu / Angela M Kirykowicz / Jeremy D Woodward / 要旨: Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced ...Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced nitrilases with altered specificity. Plant nitrilase substrate size and specificity correlate with helical twist, but molecular details of this relationship are lacking. Here we determine, to our knowledge, the first close-to-atomic resolution (3.4 Å) cryo-EM structure of an active helical nitrilase, the nitrilase 4 from . We apply site-saturation mutagenesis directed evolution to three residues (R95, S224, and L169) and generate a mutant with an altered helical twist that accepts substrates not catalyzed by known plant nitrilases. We reveal that a loop between α2 and α3 limits the length of the binding pocket and propose that it shifts position as a function of helical twist. These insights will allow us to start designing nitrilases for chemoenzymatic synthesis. | |||||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | EMマップ: SurfViewMolmilJmol/JSmol |
添付画像 |
-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_4407.map.gz | 299.1 KB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-4407-v30.xml emd-4407.xml | 11.7 KB 11.7 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
画像 | emd_4407.png | 61.7 KB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-4407 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-4407 | HTTPS FTP |
-検証レポート
文書・要旨 | emd_4407_validation.pdf.gz | 210.7 KB | 表示 | EMDB検証レポート |
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文書・詳細版 | emd_4407_full_validation.pdf.gz | 209.9 KB | 表示 | |
XML形式データ | emd_4407_validation.xml.gz | 5.2 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-4407 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-4407 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_4407.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 1 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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注釈 | Synechocystis sp. PCC6803 (BAA10717.1) nitrilase truncated at residue 291 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
投影像・断面図 | 画像のコントロール
画像は Spider により作成 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 4.11 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
CCP4マップ ヘッダ情報:
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-添付データ
-試料の構成要素
-全体 : Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291
全体 | 名称: Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291 |
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要素 |
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-超分子 #1: Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291
超分子 | 名称: Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291 タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all |
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由来(天然) | 生物種: Synechocystis sp. PCC 6803 (バクテリア) |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換プラスミド: pET-21b(+) |
-分子 #1: Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291
分子 | 名称: Synechocystis sp. PCC6803 nitrilase truncated at residue 291 タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / 光学異性体: LEVO / EC番号: nitrilase |
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由来(天然) | 生物種: Synechocystis sp. PCC 6803 (バクテリア) |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) |
配列 | 文字列: HHHHHHGSHM LGKIMLNYTK NIRAAAAQIS PVLFSQQGTM EKVLDAIANA AKKGVELIVF PETFVPYYPY FSFVEPPVLM GKSHLKLYQE AVTVPGKVTQ AIAQAAKTHG MVVVLGVNER EEGSLYNTQL IFDADGALVL KRRKITPTYH ERMVWGQGDG AGLRTVDTTV ...文字列: HHHHHHGSHM LGKIMLNYTK NIRAAAAQIS PVLFSQQGTM EKVLDAIANA AKKGVELIVF PETFVPYYPY FSFVEPPVLM GKSHLKLYQE AVTVPGKVTQ AIAQAAKTHG MVVVLGVNER EEGSLYNTQL IFDADGALVL KRRKITPTYH ERMVWGQGDG AGLRTVDTTV GRLGALACWE HYNPLARYAL MAQHEQIHCG QFPGSMVGQI FADQMEVTMR HHALESGCFV INATGWLTAE QKLQITTDEK MHQALSGGCY TAIISPEGKH LCEPIAEGEG LAIADLDFSL IAKRKRMMDS |
-実験情報
-構造解析
手法 | ネガティブ染色法 |
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解析 | らせん対称体再構成法 |
試料の集合状態 | filament |
-試料調製
濃度 | 0.3 mg/mL | |||||||||
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緩衝液 | pH: 8 構成要素:
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染色 | タイプ: NEGATIVE / 材質: Uranyl acetate |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | FEI TECNAI 20 |
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撮影 | フィルム・検出器のモデル: GATAN ULTRASCAN 4000 (4k x 4k) 撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 50 / 平均露光時間: 1.0 sec. / 平均電子線量: 20.0 e/Å2 |
電子線 | 加速電圧: 200 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.1 mm / 最大 デフォーカス(公称値): 0.5 µm / 最小 デフォーカス(公称値): 0.5 µm / 倍率(公称値): 50000 |
試料ステージ | 試料ホルダーモデル: PHILIPS ROTATION HOLDER |