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- EMDB-2796: Membrane bound pleurotolysin prepore (TMH2 strand lock) trapped w... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-2796
タイトルMembrane bound pleurotolysin prepore (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide cross-link
マップデータThis TMH2 strand disulphide trap mutant (V277C, K291C) was engineered on a background PlyB variant that lacks the wildtype cysteine (C487A) in order to avoid incorrect disulphide bond formation.
試料
  • 試料: pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide
  • タンパク質・ペプチド: pleurotolysin A
  • タンパク質・ペプチド: pleurotolysin B
キーワードMACPF/CDC superfamily / pore-forming proteins
機能・相同性
機能・相同性情報


hemolysis by symbiont of host erythrocytes
類似検索 - 分子機能
Pleurotolysin B, C-terminal / Pleurotolysin B C-terminal domain / Fungal MACPF-like domain / Hemolysin, aegerolysin type / Hemolysin, aegerolysin type / Aegerolysin / Membrane attack complex/perforin (MACPF) domain profile. / Membrane attack complex component/perforin (MACPF) domain / Membrane attack complex component/perforin (MACPF) domain
類似検索 - ドメイン・相同性
Pleurotolysin B / Pleurotolysin A
類似検索 - 構成要素
生物種Pleurotus ostreatus (ヒラタケ)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 14.0 Å
データ登録者Lukoyanova N / Kondos SC / Farabella I / Law RHP / Reboul CF / Caradoc-Davies TT / Spicer BA / Kleifeld O / Perugini M / Ekkel S ...Lukoyanova N / Kondos SC / Farabella I / Law RHP / Reboul CF / Caradoc-Davies TT / Spicer BA / Kleifeld O / Perugini M / Ekkel S / Hatfaludi T / Oliver K / Hotze EM / Tweten RK / Whisstock JC / Topf M / Dunstone MA / Saibil HR
引用ジャーナル: PLoS Biol / 年: 2015
タイトル: Conformational changes during pore formation by the perforin-related protein pleurotolysin.
著者: Natalya Lukoyanova / Stephanie C Kondos / Irene Farabella / Ruby H P Law / Cyril F Reboul / Tom T Caradoc-Davies / Bradley A Spicer / Oded Kleifeld / Daouda A K Traore / Susan M Ekkel / Ilia ...著者: Natalya Lukoyanova / Stephanie C Kondos / Irene Farabella / Ruby H P Law / Cyril F Reboul / Tom T Caradoc-Davies / Bradley A Spicer / Oded Kleifeld / Daouda A K Traore / Susan M Ekkel / Ilia Voskoboinik / Joseph A Trapani / Tamas Hatfaludi / Katherine Oliver / Eileen M Hotze / Rodney K Tweten / James C Whisstock / Maya Topf / Helen R Saibil / Michelle A Dunstone /
要旨: Membrane attack complex/perforin-like (MACPF) proteins comprise the largest superfamily of pore-forming proteins, playing crucial roles in immunity and pathogenesis. Soluble monomers assemble into ...Membrane attack complex/perforin-like (MACPF) proteins comprise the largest superfamily of pore-forming proteins, playing crucial roles in immunity and pathogenesis. Soluble monomers assemble into large transmembrane pores via conformational transitions that remain to be structurally and mechanistically characterised. Here we present an 11 Å resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the two-part, fungal toxin Pleurotolysin (Ply), together with crystal structures of both components (the lipid binding PlyA protein and the pore-forming MACPF component PlyB). These data reveal a 13-fold pore 80 Å in diameter and 100 Å in height, with each subunit comprised of a PlyB molecule atop a membrane bound dimer of PlyA. The resolution of the EM map, together with biophysical and computational experiments, allowed confident assignment of subdomains in a MACPF pore assembly. The major conformational changes in PlyB are a ∼70° opening of the bent and distorted central β-sheet of the MACPF domain, accompanied by extrusion and refolding of two α-helical regions into transmembrane β-hairpins (TMH1 and TMH2). We determined the structures of three different disulphide bond-trapped prepore intermediates. Analysis of these data by molecular modelling and flexible fitting allows us to generate a potential trajectory of β-sheet unbending. The results suggest that MACPF conformational change is triggered through disruption of the interface between a conserved helix-turn-helix motif and the top of TMH2. Following their release we propose that the transmembrane regions assemble into β-hairpins via top down zippering of backbone hydrogen bonds to form the membrane-inserted β-barrel. The intermediate structures of the MACPF domain during refolding into the β-barrel pore establish a structural paradigm for the transition from soluble monomer to pore, which may be conserved across the whole superfamily. The TMH2 region is critical for the release of both TMH clusters, suggesting why this region is targeted by endogenous inhibitors of MACPF function.
履歴
登録2014年10月14日-
ヘッダ(付随情報) 公開2014年11月19日-
マップ公開2015年2月18日-
更新2015年8月19日-
現状2015年8月19日処理サイト: PDBe / 状態: 公開

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構造の表示

ムービー
  • 表面図（断面を密度値に従い着色）
  • 表面レベル: 0.0002
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • 表面図（円筒半径に従い着色）
  • 表面レベル: 0.0002
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • あてはめたモデルとの重ね合わせ
  • 原子モデル: PDB-4v3n
  • 表面レベル: 0.0002
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • 単純化した表面モデル + あてはめた原子モデル
  • 原子モデルPDB-4v3n
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューアEMマップ:
SurfViewMolmilJmol/JSmol
添付画像

EMD-2796_ima...

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_2796.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 29.8 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
注釈This TMH2 strand disulphide trap mutant (V277C, K291C) was engineered on a background PlyB variant that lacks the wildtype cysteine (C487A) in order to avoid incorrect disulphide bond formation.
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
2 Å/pix.
x 200 pix.
= 400. Å		2 Å/pix.
x 200 pix.
= 400. Å		2 Å/pix.
x 200 pix.
= 400. Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 2 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.0002 / ムービー #1: 0.0002
最小 - 最大-0.00209311 - 0.00225684
平均 (標準偏差)0.00001894 (±0.00021508)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ200200200
Spacing200200200
セルA=B=C: 400.0 Å
α=β=γ: 90.0 °

CCP4マップ ヘッダ情報:

modeImage stored as Reals
Å/pix. X/Y/Z222
M x/y/z200200200
origin x/y/z0.0000.0000.000
length x/y/z400.000400.000400.000
α/β/γ90.00090.00090.000
MAP C/R/S123
start NC/NR/NS000
NC/NR/NS200200200
D min/max/mean-0.0020.0020.000

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添付データ

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試料の構成要素

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全体 : pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped wit...

全体名称: pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide
要素
  • 試料: pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide
  • タンパク質・ペプチド: pleurotolysin A
  • タンパク質・ペプチド: pleurotolysin B

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超分子 #1000: pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped wit...

超分子名称: pleurotolysin prepore on liposomes (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide
タイプ: sample / ID: 1000
詳細: 13 fold symmetrical ring oligomers of 26 PlyA and 13 PlyB (C487A, V277C, K291C variant) molecules on liposomes
Number unique components: 2

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分子 #1: pleurotolysin A

分子名称: pleurotolysin A / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / Name.synonym: PlyA / コピー数: 26 / 組換発現: Yes
由来(天然)生物種: Pleurotus ostreatus (ヒラタケ) / 別称: Oyster mushroom, White-rot fungus
分子量理論値: 17 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: Codon Plus pLysS (Novagen) / 組換プラスミド: pET3a
配列UniProtKB: Pleurotolysin A / GO: hemolysis by symbiont of host erythrocytes / InterPro: Hemolysin, aegerolysin type

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分子 #2: pleurotolysin B

分子名称: pleurotolysin B / タイプ: protein_or_peptide / ID: 2 / Name.synonym: PlyB / 詳細: C487A, V277C, K291C variant / コピー数: 13 / 組換発現: Yes
由来(天然)生物種: Pleurotus ostreatus (ヒラタケ) / 別称: Oyster mushroom, White-rot fungus
分子量理論値: 52 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: Codon Plus pLysS (Novagen) / 組換プラスミド: pUC57, pET3a
配列UniProtKB: Pleurotolysin B / GO: hemolysis by symbiont of host erythrocytes
InterPro: Membrane attack complex component/perforin (MACPF) domain

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

濃度0.02 mg/mL
緩衝液pH: 7.4 / 詳細: 50 mM NaCl, 20 mM Hepes
グリッド詳細: 300 mesh lacey copper grids
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 80 % / 装置: FEI VITROBOT MARK III
手法: Pleurotolysin A was first added to sphingomyelin/cholesterol liposomes at a molar ratio of 1:2000 protein to lipid in the above buffer. After 5 min incubation at room temperature, ...手法: Pleurotolysin A was first added to sphingomyelin/cholesterol liposomes at a molar ratio of 1:2000 protein to lipid in the above buffer. After 5 min incubation at room temperature, pleurotolysin B was added to the mixture at a molar ratio of 1:2 to pleurotolysin A. The mixture was incubated at 40 C or room temperature for 30 min after which 3.5 uL were placed on negatively glow discharged lacey grids and vitrified in liquid ethane using a Vitrobot. Blotting was carried out at 36 C and 80% humidity.

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI POLARA 300
温度最低: 90 K / 最高: 102 K / 平均: 94 K
アライメント法Legacy - 非点収差: Objective lens astigmatism was corrected at 115,000 times magnification
日付2013年3月5日
撮影カテゴリ: CCD
フィルム・検出器のモデル: GATAN ULTRASCAN 4000 (4k x 4k)
デジタル化 - サンプリング間隔: 15 µm / 実像数: 210 / 平均電子線量: 25 e/Å2 / ビット/ピクセル: 16
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系倍率（補正後）: 76148 / 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.3 mm / 最大 デフォーカス（公称値）: 3.4 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.8 µm / 倍率（公称値）: 59000
試料ステージ試料ホルダー: liquid nitrogen cooled / 試料ホルダーモデル: GATAN HELIUM
実験機器
モデル: Tecnai Polara / 画像提供: FEI Company

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画像解析

詳細2,700 prepore side views with adjacent membrane regions were extracted from liposome images and treated as single particles. These particles were initially used to separate 12- and 13-fold symmetries by angular reconstitution followed by competitive projection matching.
CTF補正詳細: Estimated with CTFFIND3, then phases flipped for each particle
最終 再構成想定した対称性 - 点群: C13 (13回回転対称) / アルゴリズム: OTHER / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 14.0 Å / 解像度の算出法: OTHER / ソフトウェア - 名称: Imagic, Spider / 詳細: SPIDER operation BP RP was used for reconstruction / 使用した粒子像数: 1110

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原子モデル構築 1

初期モデルPDB ID:

4oeb

ソフトウェア名称: Chimera
精密化空間: REAL / プロトコル: RIGID BODY FIT
当てはまり具合の基準: cross-correlation coefficient
得られたモデル

PDB-4v3n:
Membrane bound pleurotolysin prepore (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide cross-link

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原子モデル構築 2

初期モデルPDB ID:

4oej

ソフトウェア名称: Chimera, Flex-EM, Modeller, TEMPy
精密化空間: REAL / プロトコル: FLEXIBLE FIT
当てはまり具合の基準: cross-correlation coefficient
得られたモデル

PDB-4v3n:
Membrane bound pleurotolysin prepore (TMH2 strand lock) trapped with engineered disulphide cross-link

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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