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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-0320 | |||||||||
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タイトル | Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure. | |||||||||
マップデータ | Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 | |||||||||
試料 |
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キーワード | NITRILASE / Cyanide detoxification / Beta-cyano-L-alanine hydrolase / Helical filament / HYDROLASE | |||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrile hydratase activity ...cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrile hydratase activity / plasma membrane / cytosol 類似検索 - 分子機能 | |||||||||
生物種 | Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ) | |||||||||
手法 | らせん対称体再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.4 Å | |||||||||
データ登録者 | Mulelu AE / Woodward JD | |||||||||
資金援助 | 南アフリカ, 英国, 2件
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引用 | ジャーナル: Commun Biol / 年: 2019 タイトル: Cryo-EM and directed evolution reveal how nitrilase specificity is influenced by its quaternary structure. 著者: Andani E Mulelu / Angela M Kirykowicz / Jeremy D Woodward / 要旨: Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced ...Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced nitrilases with altered specificity. Plant nitrilase substrate size and specificity correlate with helical twist, but molecular details of this relationship are lacking. Here we determine, to our knowledge, the first close-to-atomic resolution (3.4 Å) cryo-EM structure of an active helical nitrilase, the nitrilase 4 from . We apply site-saturation mutagenesis directed evolution to three residues (R95, S224, and L169) and generate a mutant with an altered helical twist that accepts substrates not catalyzed by known plant nitrilases. We reveal that a loop between α2 and α3 limits the length of the binding pocket and propose that it shifts position as a function of helical twist. These insights will allow us to start designing nitrilases for chemoenzymatic synthesis. | |||||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | EMマップ: SurfViewMolmilJmol/JSmol |
添付画像 |
-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_0320.map.gz | 25.4 MB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-0320-v30.xml emd-0320.xml | 13.1 KB 13.1 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
FSC (解像度算出) | emd_0320_fsc.xml | 9 KB | 表示 | FSCデータファイル |
画像 | emd_0320.png | 96.8 KB | ||
Filedesc metadata | emd-0320.cif.gz | 6.2 KB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-0320 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-0320 | HTTPS FTP |
-検証レポート
文書・要旨 | emd_0320_validation.pdf.gz | 583.7 KB | 表示 | EMDB検証レポート |
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文書・詳細版 | emd_0320_full_validation.pdf.gz | 583.3 KB | 表示 | |
XML形式データ | emd_0320_validation.xml.gz | 10.9 KB | 表示 | |
CIF形式データ | emd_0320_validation.cif.gz | 14.3 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-0320 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-0320 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_0320.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 67 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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注釈 | Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
投影像・断面図 | 画像のコントロール
画像は Spider により作成 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 0.85 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
CCP4マップ ヘッダ情報:
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-添付データ
-試料の構成要素
-全体 : Active helical nitrilase complex
全体 | 名称: Active helical nitrilase complex |
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要素 |
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-超分子 #1: Active helical nitrilase complex
超分子 | 名称: Active helical nitrilase complex / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all |
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由来(天然) | 生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ) |
-分子 #1: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
分子 | 名称: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 12 / 光学異性体: LEVO / EC番号: nitrilase |
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由来(天然) | 生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ) |
分子量 | 理論値: 39.766113 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌) |
配列 | 文字列: MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFE LAIGSRTAKG RDDFRKYHAS AIDVPGPEVE RLALMAKKYK VYLVMGVIER EGYTLYCTVL FFDSQGLFLG K HRKLMPTA ...文字列: MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFE LAIGSRTAKG RDDFRKYHAS AIDVPGPEVE RLALMAKKYK VYLVMGVIER EGYTLYCTVL FFDSQGLFLG K HRKLMPTA LERCIWGFGD GSTIPVFDTP IGKIGAAICW ENRMPSLRTA MYAKGIEIYC APTADSRETW LASMTHIALE GG CFVLSAN QFCRRKDYPS PPEYMFSGSE ESLTPDSVVC AGGSSIISPL GIVLAGPNYR GEALITADLD LGDIARAKFD FDV VGHYSR PEVFSLNIRE HPRKAVSFKT SKVMEDESVH HHHHH UniProtKB: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4 |
-実験情報
-構造解析
手法 | クライオ電子顕微鏡法 |
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解析 | らせん対称体再構成法 |
試料の集合状態 | filament |
-試料調製
濃度 | 0.15 mg/mL | |||||||||
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緩衝液 | pH: 8 構成要素:
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グリッド | モデル: Quantifoil, UltrAuFoil, R1.2/1.3 / 材質: GOLD / メッシュ: 400 / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE / 前処理 - 時間: 60 sec. / 前処理 - 雰囲気: AIR | |||||||||
凍結 | 凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 50 % / チャンバー内温度: 293 K / 装置: FEI VITROBOT MARK I 詳細: The sample (2.5 ul) was applied to the grid and incubated for 30 seconds at 50% humidity before blotting and plunging.. |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | FEI TITAN KRIOS |
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撮影 | フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k) 検出モード: COUNTING / デジタル化 - サイズ - 横: 3838 pixel / デジタル化 - サイズ - 縦: 3710 pixel / 撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 1266 / 平均露光時間: 7.0 sec. / 平均電子線量: 45.5 e/Å2 |
電子線 | 加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.7 mm / 最大 デフォーカス(公称値): 2.0 µm / 最小 デフォーカス(公称値): 0.75 µm |
試料ステージ | 試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER ホルダー冷却材: NITROGEN |
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
+画像解析
-原子モデル構築 1
詳細 | Ab initio fitting was performed using Buccaneer, cleaned up with Coot and Phenix Real-Space Refine. |
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精密化 | 空間: REAL / プロトコル: AB INITIO MODEL 当てはまり具合の基準: Cross-correlation coefficient |
得られたモデル | PDB-6i00: |