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万見
- PDB-8ywh: Cryo-EM structure of small and dead form SaCas9-RNA-DNA ternary c... -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 8ywh
タイトルCryo-EM structure of small and dead form SaCas9-RNA-DNA ternary complex (sdCas9)
要素
  • Non-target DNA
  • Target DNA
  • sCas9 (Compact SaCas9)
  • sgRNA
キーワードDNA BINDING PROTEIN / CRISPR/Cas9 / Thermostable protein engineering / Domain minimized Cas / engineered SaCas9
機能・相同性: / DNA / DNA (> 10) / RNA / RNA (> 10)
機能・相同性情報
生物種Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
synthetic construct (人工物)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.97 Å
データ登録者Kang, E.S. / Kim, N.H. / Thach, T.T. / Hyun, J. / Kim, Y.H.
資金援助 韓国, 2件
組織認可番号国
National Research Foundation (NRF, Korea)NRF-2023R1A2C300573 韓国
National Research Foundation (NRF, Korea)RS-2023-00302458 韓国
引用ジャーナル: Adv Mater / 年: 2025
タイトル: Structure-Guided Engineering of Thermodynamically Enhanced SaCas9 for Improved Gene Suppression.
著者: Eun Sung Kang / Nam Hyeong Kim / Hyun-Kyoung Lim / Hyeyeon Jeon / Kayoung Han / Young Hyun No / Kyungtae Kim / Zinah Hilal Khaleel / Dongsun Shin / Kilho Eom / Jiyoung Nam / Bok-Soo Lee / Han- ...著者: Eun Sung Kang / Nam Hyeong Kim / Hyun-Kyoung Lim / Hyeyeon Jeon / Kayoung Han / Young Hyun No / Kyungtae Kim / Zinah Hilal Khaleel / Dongsun Shin / Kilho Eom / Jiyoung Nam / Bok-Soo Lee / Han-Joo Kim / Minah Suh / Jaecheol Lee / Trung Thanh Thach / Jaekyung Hyun / Yong Ho Kim /
要旨: Proteins with multiple domains play pivotal roles in various biological processes, necessitating a thorough understanding of their structural stability and functional interplay. Here, a structure- ...Proteins with multiple domains play pivotal roles in various biological processes, necessitating a thorough understanding of their structural stability and functional interplay. Here, a structure-guided protein engineering approach is proposed to develop thermostable Cas9 (CRISPR-associated protein 9) variant for CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) interference applications. By employing thermodynamic analysis, combining distance mapping and molecular dynamics simulations, deletable domains are identified to enhance stability while preserving the DNA recognition function of Cas9. The resulting engineered Cas9, termed small and dead form Cas9, exhibits improved thermostability and maintains target DNA recognition function. Cryo-electron microscopy analysis reveals structural integrity with reduced atomic density in the deleted domain. Fusion with functional elements enables intracellular delivery and nuclear localization, demonstrating efficient gene suppression in diverse cell types. Direct delivery in the mouse brain shows enhanced knockdown efficiency, highlighting the potential of structure-guided engineering to develop functional CRISPR systems tailored for specific applications. This study underscores the significance of integrating computational and experimental approaches for protein engineering, offering insights into designing tailored molecular tools for precise biological interventions.
履歴
登録2024年3月31日登録サイト: PDBJ / 処理サイト: PDBJ
改定 1.02025年4月2日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.02025年4月2日Data content type: EM metadata / Data content type: EM metadata / Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.02025年4月2日Data content type: Half map / Part number: 1 / Data content type: Half map / Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.02025年4月2日Data content type: Half map / Part number: 2 / Data content type: Half map / Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.02025年4月2日Data content type: Image / Data content type: Image / Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.02025年4月2日Data content type: Primary map / Data content type: Primary map / Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12025年6月25日Group: Data collection / カテゴリ: em_admin / em_software / Item: _em_admin.last_update
改定 1.12025年6月25日Data content type: EM metadata / Data content type: EM metadata / EM metadata / Group: Data processing / Experimental summary / Data content type: EM metadata / EM metadata / カテゴリ: em_admin / em_software / Data content type: EM metadata / Item: _em_admin.last_update
改定 1.22025年7月16日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / em_admin
Item: _citation.journal_volume / _citation.year / _em_admin.last_update

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: sCas9 (Compact SaCas9)
B: sgRNA
C: Target DNA
D: Non-target DNA


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)172,0474
ポリマ－172,0474
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
  • 根拠: 電子顕微鏡法, not applicable
タイプ名称対称操作数
identity operation1_555x,y,z1

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要素

#1: タンパク質 sCas9 (Compact SaCas9)


分子量: 104196.102 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)
#2: RNA鎖 sgRNA


分子量: 31483.635 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#3: DNA鎖 Target DNA


分子量: 18083.580 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) / 参照: GenBank: 887958
#4: DNA鎖 Non-target DNA


分子量: 18283.701 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) / 参照: GenBank: 887958
Has protein modificationN

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素名称: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex
タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT
分子量値: 0.106 MDa / 実験値: YES
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli (大腸菌)
緩衝液pH: 7.4
詳細: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP
緩衝液成分濃度: 20 mM / 名称: Tris, NaCl, MgCl buffer / 式: Tris-HCl
試料濃度: 0.6 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
詳細: Cas9: sgRNA: DNA ternary complex was generated by combining purified Cas9 protein, sgRNA, and dsDNA in molar ratios of 1:1.2:1.3, incubated at room temperature for 1 hour in 20 mM Tris-HCl, ...詳細: Cas9: sgRNA: DNA ternary complex was generated by combining purified Cas9 protein, sgRNA, and dsDNA in molar ratios of 1:1.2:1.3, incubated at room temperature for 1 hour in 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP.
試料支持詳細: -15 mA / グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 300 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 95 % / 凍結前の試料温度: 277 K

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2000 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 700 nm / Cs: 0.1 mm / C2レンズ絞り径: 70 µm
撮影平均露光時間: 19.24 sec. / 電子線照射量: 50 e/Å2
フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k)
実像数: 50
電子光学装置エネルギーフィルター名称: GIF Bioquantum

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解析

EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ詳細
1cryoSPARC4.4.1粒子像選択
2cryoSPARC4.4.1画像取得
3Topaz画像取得
4RELION5画像取得
5ResMap1.1.4画像取得
7RELION5CTF補正
10PHENIX1.20.1モデルフィッティング4487-000
12RELION5初期オイラー角割当
13RELION5最終オイラー角割当
14cryoSPARC4.4.1分類
15RELION5３次元再構成
16Coot0.8.9.3モデル精密化8011
23PHENIXモデル精密化
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
粒子像の選択選択した粒子像数: 1758133
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 2.97 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 162748 / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築プロトコル: AB INITIO MODEL
原子モデル構築PDB-ID: 5AXW

5axw


PDB chain-ID: a / Accession code: 5AXW / Chain residue range: 1-1053
詳細: The initial model generated from 5AXW without HNH and Linker domain
Pdb chain residue range: 1-1053 / Source name: PDB / タイプ: experimental model
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.00410429
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d0.6814703
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d23.372811
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.0411706
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.0041364

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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