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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 8wuu | ||||||
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タイトル | SpCas9-pegRNA-target DNA complex (pre-initiation) | ||||||
要素 |
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キーワード | RNA BINDING PROTEIN/RNA/DNA / CRISPR-Cas / RNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex | ||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||
生物種 | Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.2 Å | ||||||
データ登録者 | Shuto, Y. / Nakagawa, R. / Hoki, M. / Omura, S.N. / Hirano, H. / Itoh, Y. / Nureki, O. | ||||||
資金援助 | 日本, 1件
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引用 | ジャーナル: Nature / 年: 2024 タイトル: Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor. 著者: Yutaro Shuto / Ryoya Nakagawa / Shiyou Zhu / Mizuki Hoki / Satoshi N Omura / Hisato Hirano / Yuzuru Itoh / Feng Zhang / Osamu Nureki / 要旨: The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing ...The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing guide RNA (pegRNA) to facilitate a wide variety of precise genome edits in living cells. However, owing to a lack of structural information, the molecular mechanism of pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor remains poorly understood. Here we present cryo-electron microscopy structures of the SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA complex in multiple states. The termination structure, along with our functional analysis, reveals that M-MLV RT extends reverse transcription beyond the expected site, resulting in scaffold-derived incorporations that cause undesired edits at the target loci. Furthermore, structural comparisons among the pre-initiation, initiation and elongation states show that M-MLV RT remains in a consistent position relative to SpCas9 during reverse transcription, whereas the pegRNA-synthesized DNA heteroduplex builds up along the surface of SpCas9. On the basis of our structural insights, we rationally engineered pegRNA variants and prime-editor variants in which M-MLV RT is fused within SpCas9. Collectively, our findings provide structural insights into the stepwise mechanism of prime editing, and will pave the way for the development of a versatile prime editing toolbox. | ||||||
履歴 |
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-構造の表示
構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
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-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 8wuu.cif.gz | 398.1 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb8wuu.ent.gz | 表示 | PDB形式 | |
PDBx/mmJSON形式 | 8wuu.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 8wuu_validation.pdf.gz | 1.1 MB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 8wuu_full_validation.pdf.gz | 1.1 MB | 表示 | |
XML形式データ | 8wuu_validation.xml.gz | 46.8 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 8wuu_validation.cif.gz | 73.8 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/wu/8wuu ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/wu/8wuu | HTTPS FTP |
-関連構造データ
関連構造データ | 37860MC 8wusC 8wutC 8wuvC 8ygjC M: このデータのモデリングに利用したマップデータ C: 同じ文献を引用 (文献) |
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類似構造データ | 類似検索 - 機能・相同性F&H 検索 |
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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1 |
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-要素
#1: タンパク質 | 分子量: 158457.578 Da / 分子数: 1 / 変異: D10A, H840A / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌) 遺伝子: cas9 発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌) 参照: UniProt: Q99ZW2 |
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#2: DNA鎖 | 分子量: 15636.033 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) 発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌) |
#3: DNA鎖 | 分子量: 5291.446 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 由来: (合成) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
#4: RNA鎖 | 分子量: 44300.379 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) 発現宿主: Teseptimavirus (ウイルス) |
#5: DNA鎖 | 分子量: 10462.743 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 由来: (合成) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 | 名称: SpCas9-pegRNA-target DNA complex / タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT |
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分子量 | 実験値: NO |
由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
由来(組換発現) | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
緩衝液 | pH: 8 |
試料 | 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES |
急速凍結 | 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 297 K |
-電子顕微鏡撮影
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス(公称値): 1600 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 800 nm |
撮影 | 電子線照射量: 50 e/Å2 / フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) |
-解析
CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||
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3次元再構成 | 解像度: 3.2 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 197777 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||
拘束条件 |
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