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- PDB-8flj: Cas1-Cas2/3 integrase and IHF bound to CRISPR leader, repeat and ... -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 8flj
タイトルCas1-Cas2/3 integrase and IHF bound to CRISPR leader, repeat and foreign DNA
要素
  • (CRISPR-associated ...) x 2
  • (Integration host factor subunit ...) x 2
  • CRISPR leader and repeat, anti-sense strand of DNA
  • CRISPR leader, sense strand of DNA
  • CRISPR repeat and prespacer, sense strand of DNA
  • Prespacer, anti-sense strand of DNA
キーワードRECOMBINATION / DNA BINDING PROTEIN / HYDROLASE/DNA / DNA integration / maintenance of CRISPR repeat elements / IHF-DNA complex / Enzymes altering nucleic acid conformation / Site specific endodeoxyribonucleases: cleavage is not sequence specific / Nucleotidyltransferases / GO:0008301 / HYDROLASE-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


positive regulation of metabolic process / maintenance of CRISPR repeat elements / DNA endonuclease activity / helicase activity / 加水分解酵素; 酸無水物に作用; 酸無水物に作用・細胞または細胞小器官の運動に関与 / structural constituent of chromatin / regulation of translation / chromosome / DNA recombination / defense response to virus ...positive regulation of metabolic process / maintenance of CRISPR repeat elements / DNA endonuclease activity / helicase activity / 加水分解酵素; 酸無水物に作用; 酸無水物に作用・細胞または細胞小器官の運動に関与 / structural constituent of chromatin / regulation of translation / chromosome / DNA recombination / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / hydrolase activity / regulation of DNA-templated transcription / DNA binding / ATP binding / metal ion binding / identical protein binding / cytosol
類似検索 - 分子機能
Helicase Cas3, CRISPR-associated, Yersinia-type / : / : / CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3, I-F/YPEST, Cas2 domain / CRISPR-associated Cas3 subtype I-F/YPEST-like, C-terminal domain / CRISPR-associated protein Cas1, YPEST subtype / Integration host factor, alpha subunit / Integration host factor, beta subunit / Cas3, HD domain / : ...Helicase Cas3, CRISPR-associated, Yersinia-type / : / : / CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3, I-F/YPEST, Cas2 domain / CRISPR-associated Cas3 subtype I-F/YPEST-like, C-terminal domain / CRISPR-associated protein Cas1, YPEST subtype / Integration host factor, alpha subunit / Integration host factor, beta subunit / Cas3, HD domain / : / CRISPR-associated Cas3-type HD domain / CRISPR-associated Cas3-type HD domain superfamily / CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3, C-terminal / HD Cas3-type domain profile. / CRISPR-associated endonuclease Cas1, N-terminal domain / : / CRISPR-associated protein Cas1 / CRISPR-associated endonuclease Cas1, C-terminal domain / CRISPR associated protein Cas1 / Histone-like DNA-binding protein, conserved site / Bacterial histone-like DNA-binding proteins signature. / Histone-like DNA-binding protein / Bacterial DNA-binding protein / bacterial (prokaryotic) histone like domain / Integration host factor (IHF)-like DNA-binding domain superfamily / P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase
類似検索 - ドメイン・相同性
DNA / DNA (> 10) / DNA (> 100) / CRISPR-associated endonuclease Cas1 / CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3 subtype I-F/YPEST / Integration host factor subunit alpha / Integration host factor subunit beta
類似検索 - 構成要素
生物種Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
synthetic construct (人工物)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.48 Å
データ登録者Santiago-Frangos, A. / Henriques, W.S. / Wiegand, T. / Gauvin, C. / Buyukyoruk, M. / Neselu, K. / Eng, E.T. / Lander, G.C. / Wiedenheft, B.
資金援助 米国, 11件
組織認可番号国
National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS)GM147842 米国
Life Sciences Research Foundation
Simons Foundation 米国
M.J. Murdock Charitable Trust
National Science Foundation (NSF, United States)1828765 米国
NIH Common Fund Transformative High Resolution Cryo-Electron Microscopy programGM129539
Simons FoundationSF349247 米国
National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS)GM134867 米国
Amgen
Montana State University Agricultural Experimental Station (USDA NIFA)
VIRIS Detection Systems
引用ジャーナル: Nat Struct Mol Biol / 年: 2023
タイトル: Structure reveals why genome folding is necessary for site-specific integration of foreign DNA into CRISPR arrays.
著者: Andrew Santiago-Frangos / William S Henriques / Tanner Wiegand / Colin C Gauvin / Murat Buyukyoruk / Ava B Graham / Royce A Wilkinson / Lenny Triem / Kasahun Neselu / Edward T Eng / Gabriel C ...著者: Andrew Santiago-Frangos / William S Henriques / Tanner Wiegand / Colin C Gauvin / Murat Buyukyoruk / Ava B Graham / Royce A Wilkinson / Lenny Triem / Kasahun Neselu / Edward T Eng / Gabriel C Lander / Blake Wiedenheft /
要旨: Bacteria and archaea acquire resistance to viruses and plasmids by integrating fragments of foreign DNA into the first repeat of a CRISPR array. However, the mechanism of site-specific integration ...Bacteria and archaea acquire resistance to viruses and plasmids by integrating fragments of foreign DNA into the first repeat of a CRISPR array. However, the mechanism of site-specific integration remains poorly understood. Here, we determine a 560-kDa integration complex structure that explains how Pseudomonas aeruginosa Cas (Cas1-Cas2/3) and non-Cas proteins (for example, integration host factor) fold 150 base pairs of host DNA into a U-shaped bend and a loop that protrude from Cas1-2/3 at right angles. The U-shaped bend traps foreign DNA on one face of the Cas1-2/3 integrase, while the loop places the first CRISPR repeat in the Cas1 active site. Both Cas3 proteins rotate 100 degrees to expose DNA-binding sites on either side of the Cas2 homodimer, which each bind an inverted repeat motif in the leader. Leader sequence motifs direct Cas1-2/3-mediated integration to diverse repeat sequences that have a 5'-GT. Collectively, this work reveals new DNA-binding surfaces on Cas2 that are critical for DNA folding and site-specific delivery of foreign DNA.
履歴
登録2022年12月21日登録サイト: RCSB / 処理サイト: RCSB
改定 1.02023年9月6日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12023年9月20日Group: Database references / カテゴリ: citation / citation_author / Item: _citation.title / _citation_author.name
改定 1.22023年9月27日Group: Database references / カテゴリ: citation / citation_author / Item: _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title
改定 1.32023年11月22日Group: Database references / カテゴリ: citation / citation_author
Item: _citation.journal_volume / _citation.page_first ..._citation.journal_volume / _citation.page_first / _citation.page_last / _citation_author.identifier_ORCID

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: CRISPR-associated endonuclease Cas1
B: CRISPR-associated endonuclease Cas1
C: CRISPR-associated endonuclease Cas1
D: CRISPR-associated endonuclease Cas1
E: Integration host factor subunit alpha
F: Integration host factor subunit beta
G: Integration host factor subunit alpha
H: Integration host factor subunit beta
I: CRISPR leader, sense strand of DNA
J: CRISPR leader and repeat, anti-sense strand of DNA
K: CRISPR repeat and prespacer, sense strand of DNA
L: Prespacer, anti-sense strand of DNA
M: CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3 subtype I-F/YPEST
N: CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3 subtype I-F/YPEST


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)562,66214
ポリマ－562,66214
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者が定義した集合体
  • 根拠: gel filtration, The I-F integration complex was assembled from purified DNAs, IHF and Cas1-2/3 as described in the methods section, and the assembled complex was further purified by size- ...根拠: gel filtration, The I-F integration complex was assembled from purified DNAs, IHF and Cas1-2/3 as described in the methods section, and the assembled complex was further purified by size-exclusion chromatography (SEC) (Superdex 200 10/300, Cytiva). Individual fractions were collected along the elution profile, and were concentrated and stored separately for further analysis and imaging. Individual SEC fractions were analyzed by SDS-PAGE to determine which fractions contained all the proteins necessary for a complete complex. Individual SEC fractions were phenol-chloroform extracted, and the aqueous layer was analyzed by Urea-PAGE to determine which fractions contained all four DNA strands necessary for a complete complex. The fraction chosen for cryo-EM analysis contains all polypeptides and DNA strands required for a complete complex.
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551

-
要素

-
CRISPR-associated ... , 2種, 6分子 ABCDMN

#1: タンパク質
CRISPR-associated endonuclease Cas1


分子量: 38267.148 Da / 分子数: 4 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
遺伝子: cas1, PA14_33350 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
参照: UniProt: Q02ML7, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素
#8: タンパク質 CRISPR-associated nuclease/helicase Cas3 subtype I-F/YPEST


分子量: 121273.680 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
遺伝子: cas3, PA14_33340 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
参照: UniProt: Q02ML8, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素, 加水分解酵素; 酸無水物に作用; 酸無水物に作用・細胞または細胞小器官の運動に関与

-
Integration host factor subunit ... , 2種, 4分子 EGFH

#2: タンパク質 Integration host factor subunit alpha / IHF-alpha


分子量: 11646.299 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
遺伝子: ihfA, himA, PA14_28720 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: Q02NN5
#3: タンパク質 Integration host factor subunit beta / IHF-beta


分子量: 10805.378 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
遺伝子: ihfB, himD, PA14_23340 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: Q02PW7

-
DNA鎖 , 4種, 4分子 IJKL

#4: DNA鎖 CRISPR leader, sense strand of DNA


分子量: 42935.559 Da / 分子数: 1
Mutation: C30A,T31A,T32A,C34A,G35A,G97A,G98A,T99A,T101A,T102A,T103C,C104G,T105C,T108C,T109G,C110A,C111A,T112A,A117C,T118G
由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
#5: DNA鎖 CRISPR leader and repeat, anti-sense strand of DNA


分子量: 52701.645 Da / 分子数: 1
Mutation: A54G,T55G,A60T,G61T,G62T,A63C,A64G,A67G,G68C,A69G,A70T,A71T,A73T,C74T,C75T,C137T,G138T,A140T,A141T,G142T
由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)
#6: DNA鎖 CRISPR repeat and prespacer, sense strand of DNA


分子量: 18241.707 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#7: DNA鎖 Prespacer, anti-sense strand of DNA


分子量: 8263.364 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)

-
詳細

研究の焦点であるリガンドがあるかN

-
実験情報

-
実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

-
試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来
1Cas1-Cas2/3 integrase and IHF bound to CRISPR leader, repeat and foreign DNACOMPLEXall0MULTIPLE SOURCES
2Cas1-Cas2/3 heterohexameric integraseCOMPLEX#1, #81RECOMBINANT
3IHF heterodimerCOMPLEX#2-#31RECOMBINANT
4CRISPR leader, repeat, and prespacer DNA annealed to mimic a half-site integration intermediate.COMPLEX#4-#71MULTIPLE SOURCES
分子量
IDEntity assembly-ID値 (°)実験値
11.56 MDaNO
21.395 MDaNO
31NO
41.122 MDaNO
由来(天然)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
22Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)652611
33Pseudomonas aeruginosa PA14 (緑膿菌)652611
由来(組換発現)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
22Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)469008
33Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)469008
緩衝液pH: 7.5
緩衝液成分
ID濃度名称Buffer-ID
120 mMTris-HCl1
2200 mMMonopotassium glutamate1
35 mMEDTA1
41 mMTCEP1
50.2 %Glycerol1
試料包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
試料支持詳細: Grids were glow discharged at 15 mA for 15 seconds with a 10 second hold (easiGlow, Pelco).
グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 200 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R2/2
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 281.15 K

-
電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 倍率（公称値）: 81000 X / 倍率（補正後）: 46860 X / 最大 デフォーカス（公称値）: 2100 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 700 nm / Cs: 2.7 mm
撮影平均露光時間: 2.5 sec. / 電子線照射量: 69 e/Å2
フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k)
実像数: 10740
電子光学装置エネルギーフィルタースリット幅: 20 eV
画像スキャン横: 11520 / 縦: 8184

-
解析

ソフトウェア
名称バージョン分類NB
phenix.real_space_refinedev_4674精密化
PHENIXdev_4674精密化
EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ
1cryoSPARC3粒子像選択
2Leginon画像取得
4cryoSPARCCTF補正
10cryoSPARC初期オイラー角割当
11cryoSPARC最終オイラー角割当
12cryoSPARC分類
13cryoSPARC３次元再構成
画像処理詳細: Patch motion correction and patch CTF correction were performed in cryoSPARC.
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
粒子像の選択選択した粒子像数: 5846923 / 詳細: Template picking
3次元再構成解像度: 3.48 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 366794 / クラス平均像の数: 1 / 対称性のタイプ: POINT
精密化最高解像度: 3.48 Å / 交差検証法: NONE
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.005233098
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d0.834846528
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.05525329
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.01074909
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d24.18967290

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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