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万見
- PDB-7vw3: Cryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 7vw3
タイトルCryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex
要素
  • CRISPR-associated endonuclease Cas9
  • Non-target DNA strand
  • Target DNA strand
  • single-guide RNA
キーワードDNA BINDING PROTEIN/RNA/DNA / CRISPR-Cas9 / genome editing / DNA cleavage / DNA BINDING PROTEIN / DNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
: / CRISPR-associated endonuclease Cas9, C-terminal domain / Cas9, PI domain / Cas9, WED domain / CRISPR-Cas9 WED domain / CRISPR-Cas9 PI domain / RuvC endonuclease subdomain 3 / RuvC endonuclease subdomain 3 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease ...: / CRISPR-associated endonuclease Cas9, C-terminal domain / Cas9, PI domain / Cas9, WED domain / CRISPR-Cas9 WED domain / CRISPR-Cas9 PI domain / RuvC endonuclease subdomain 3 / RuvC endonuclease subdomain 3 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
DNA / DNA (> 10) / RNA / RNA (> 10) / RNA (> 100) / CRISPR-associated endonuclease Cas9
類似検索 - 構成要素
生物種Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
synthetic construct (人工物)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.8 Å
データ登録者Du, W.H. / Qian, J.Q. / Huang, Q.
資金援助 中国, 2件
組織認可番号国
National Natural Science Foundation of China (NSFC)31971377 中国
National Natural Science Foundation of China (NSFC)31671386 中国
引用ジャーナル: Int J Mol Sci / 年: 2023
タイトル: Full-Length Model of SaCas9-sgRNA-DNA Complex in Cleavage State.
著者: Wenhao Du / Haixia Zhu / Jiaqiang Qian / Dongmei Xue / Sen Zheng / Qiang Huang /
要旨: Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined ... Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined the first cryo-electron microscopy structure of the SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex. This structure reveals that the HNH nuclease domain is tightly bound to the cleavage site of the target DNA strand, and is in close contact with the WED and REC domains. Moreover, it captures the complete structure of the sgRNA, including the previously unresolved stem-loop 2. Based on this structure, we build a full-length model for the ternary complex in cleavage state. This model enables identification of the residues for the interactions between the HNH domain and the WED and REC domains. Moreover, we found that the stem-loop 2 of the sgRNA tightly binds to the PI and RuvC domains and may also regulate the position shift of the RuvC domain. Further mutagenesis and molecular dynamics simulations supported the idea that the interactions of the HNH domain with the WED and REC domains play an important role in the DNA cleavage. Thus, this study provides new mechanistic insights into the DNA cleavage of SaCas9 and is also useful for guiding the future engineering of SaCas9-mediated gene editing systems.
履歴
登録2021年11月9日登録サイト: PDBJ / 処理サイト: PDBJ
改定 1.02023年3月15日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12024年6月26日Group: Data collection / Refinement description
カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond / em_3d_fitting_list
Item: _em_3d_fitting_list.accession_code / _em_3d_fitting_list.initial_refinement_model_id ..._em_3d_fitting_list.accession_code / _em_3d_fitting_list.initial_refinement_model_id / _em_3d_fitting_list.source_name / _em_3d_fitting_list.type

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: CRISPR-associated endonuclease Cas9
B: single-guide RNA
C: Target DNA strand
D: Non-target DNA strand
ヘテロ分子


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)178,1857
ポリマ－178,1134
非ポリマー733
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者が定義した集合体
  • 根拠: native gel electrophoresis
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
Buried area23810 Å2
ΔGint-177 kcal/mol
Surface area74180 Å2

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要素

#1: タンパク質 CRISPR-associated endonuclease Cas9 / SaCas9


分子量: 123940.508 Da / 分子数: 1 / 変異: D10A N580A / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
遺伝子: cas9 / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)
参照: UniProt: J7RUA5, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素
#2: RNA鎖 single-guide RNA / sgRNA


分子量: 33217.531 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#3: DNA鎖 Target DNA strand / TS


分子量: 12372.006 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#4: DNA鎖 Non-target DNA strand / NTS


分子量: 8582.533 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#5: 化合物 ChemComp-MG / MAGNESIUM ION / マグネシウムジカチオン


分子量: 24.305 Da / 分子数: 3 / 由来タイプ: 合成 / 式: Mg / タイプ: SUBJECT OF INVESTIGATION
研究の焦点であるリガンドがあるかY

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来
1SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complexCOMPLEX#1-#40MULTIPLE SOURCES
2SaCas9COMPLEX#11RECOMBINANT
3sgRNA-target DNACOMPLEX#2-#41SYNTHETIC
分子量値: 0.198 MDa / 実験値: NO
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli (大腸菌)
緩衝液pH: 7.5
詳細: 20mM Tris-Cl (pH 7.5), 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT
緩衝液成分
ID濃度名称式Buffer-ID
120.0 mMtrihydroxymethyl aminomethaneTris1
2100.0 mMpotassium chlorideKCl1
35.0 mMmagnesium chlorideMgCl21
41.0 mMdithiothreitolDTT1
試料濃度: 0.22 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES / 詳細: blot for 4 seconds before pluging
試料支持グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 200 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3
急速凍結装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 289 K

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 倍率（公称値）: 105000 X / 最大 デフォーカス（公称値）: 2600 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1800 nm
試料ホルダ凍結剤: NITROGEN
撮影電子線照射量: 38 e/Å2
フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k)
実像数: 10389
画像スキャン横: 5760 / 縦: 4096

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解析

ソフトウェア
名称バージョン分類
phenix.real_space_refine1.19.2_4158精密化
PHENIX1.19.2_4158精密化
EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ
4CTFFIND4.1CTF補正
7Rosetta3.6モデルフィッティング
10RELION3.0.8最終オイラー角割当
11RELION3.0.8分類
12RELION3.0.8３次元再構成
13PHENIX1.19.2モデル精密化
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
粒子像の選択選択した粒子像数: 3872337
詳細: We used the program PARSED developed in our previous study to pick the complex particles from the micrographs(Yao R, et al. Bioinformatics. 2020,36:1252-1259).
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 3.8 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 217173 / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築プロトコル: FLEXIBLE FIT / 空間: REAL / Target criteria: correlation coefficient
原子モデル構築
IDPDB-ID 3D fitting-IDAccession codeInitial refinement model-IDSource nameタイプ
15CZZ

5czz

15CZZ1PDBexperimental model
25Y36

5y36

15Y362PDBexperimental model
精密化交差検証法: NONE
立体化学のターゲット値: GeoStd + Monomer Library + CDL v1.2
原子変位パラメータBiso mean: 236.8 Å2
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.004912889
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d0.747818141
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.04622085
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.0051703
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d21.51373170

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbjlvh1.pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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