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万見
- EMDB-4420: Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a cha... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-4420
タイトルCryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure.
マップデータ73.2 degree conformation
試料
  • 複合体: Active helical nitrilase complex
    • タンパク質・ペプチド: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
キーワードNITRILASE / Cyanide detoxification / Beta-cyano-L-alanine hydrolase / Helical filament / HYDROLASE
機能・相同性
機能・相同性情報


cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrile hydratase activity ...cyanoalanine nitrilase / 3-cyanoalanine hydratase / cyanoalanine nitrilase activity / 3-cyanoalanine hydratase activity / cyanide metabolic process / nitrilase / indole-3-acetonitrile nitrilase activity / nitrilase activity / detoxification of nitrogen compound / nitrile hydratase activity / plasma membrane / cytosol
類似検索 - 分子機能
Nitrilases / cyanide hydratase active site signature. / Nitrilase/Cyanide hydratase / Nitrilases / cyanide hydratase signature 1. / Nitrilase/cyanide hydratase, conserved site / Carbon-nitrogen hydrolase superfamily / Carbon-nitrogen hydrolase / Carbon-nitrogen hydrolase domain profile. / Carbon-nitrogen hydrolase
類似検索 - ドメイン・相同性
Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4
類似検索 - 構成要素
生物種Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
手法らせん対称体再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.9 Å
データ登録者Mulelu AE / Woodward JD
資金援助 南アフリカ, 1件
OrganizationGrant number国
National Research Foundation in South AfricaResearch Career Advancement Fellowship 南アフリカ
引用ジャーナル: Commun Biol / 年: 2019
タイトル: Cryo-EM and directed evolution reveal how Arabidopsis nitrilase specificity is influenced by its quaternary structure.
著者: Andani E Mulelu / Angela M Kirykowicz / Jeremy D Woodward /
要旨: Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced ...Nitrilases are helical enzymes that convert nitriles to acids and/or amides. All plants have a nitrilase 4 homolog specific for ß-cyanoalanine, while in some plants neofunctionalization has produced nitrilases with altered specificity. Plant nitrilase substrate size and specificity correlate with helical twist, but molecular details of this relationship are lacking. Here we determine, to our knowledge, the first close-to-atomic resolution (3.4 Å) cryo-EM structure of an active helical nitrilase, the nitrilase 4 from Arabidopsis thaliana. We apply site-saturation mutagenesis directed evolution to three residues (R95, S224, and L169) and generate a mutant with an altered helical twist that accepts substrates not catalyzed by known plant nitrilases. We reveal that a loop between α2 and α3 limits the length of the binding pocket and propose that it shifts position as a function of helical twist. These insights will allow us to start designing nitrilases for chemoenzymatic synthesis.
履歴
登録2018年11月14日-
ヘッダ(付随情報) 公開2019年11月20日-
マップ公開2019年11月20日-
更新2024年5月15日-
現状2024年5月15日処理サイト: PDBe / 状態: 公開

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構造の表示

ムービー
  • 表面図（断面を密度値に従い着色）
  • 表面レベル: 0.025
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • 表面図（円筒半径に従い着色）
  • 表面レベル: 0.025
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • あてはめたモデルとの重ね合わせ
  • 原子モデル: PDB-6i5u
  • 表面レベル: 0.025
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
  • 単純化した表面モデル + あてはめた原子モデル
  • 原子モデルPDB-6i5u
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューアEMマップ:
SurfViewMolmilJmol/JSmol
添付画像

emd_4420.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_4420.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 67 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
注釈73.2 degree conformation
ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.85 Å
密度
表面レベル登録者による: 0.025 / ムービー #1: 0.025
最小 - 最大-0.0683879 - 0.109094195
平均 (標準偏差)0.00045632457 (±0.007359177)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ260260260
Spacing260260260
セルA=B=C: 221.0 Å
α=β=γ: 90.0 °

CCP4マップ ヘッダ情報:

modeImage stored as Reals
Å/pix. X/Y/Z0.850.850.85
M x/y/z260260260
origin x/y/z0.0000.0000.000
length x/y/z221.000221.000221.000
α/β/γ90.00090.00090.000
start NX/NY/NZ929262
NX/NY/NZ290290360
MAP C/R/S123
start NC/NR/NS000
NC/NR/NS260260260
D min/max/mean-0.0680.1090.000

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添付データ

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試料の構成要素

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全体 : Active helical nitrilase complex

全体名称: Active helical nitrilase complex
要素
  • 複合体: Active helical nitrilase complex
    • タンパク質・ペプチド: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4

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超分子 #1: Active helical nitrilase complex

超分子名称: Active helical nitrilase complex / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all
詳細: Arabidopsis thaliana NITRILASE 4 in 73.2 degree conformation
由来(天然)生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)

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分子 #1: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4

分子名称: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 6 / 光学異性体: LEVO / EC番号: nitrilase
由来(天然)生物種: Arabidopsis thaliana (シロイヌナズナ)
分子量理論値: 39.766113 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
配列文字列: MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFE LAIGSRTAKG RDDFRKYHAS AIDVPGPEVE RLALMAKKYK VYLVMGVIER EGYTLYCTVL FFDSQGLFLG K HRKLMPTA ...文字列:
MSMQQETSHM TAAPQTNGHQ IFPEIDMSAG DSSSIVRATV VQASTVFYDT PATLDKAERL LSEAAENGSQ LVVFPEAFIG GYPRGSTFE LAIGSRTAKG RDDFRKYHAS AIDVPGPEVE RLALMAKKYK VYLVMGVIER EGYTLYCTVL FFDSQGLFLG K HRKLMPTA LERCIWGFGD GSTIPVFDTP IGKIGAAICW ENRMPSLRTA MYAKGIEIYC APTADSRETW LASMTHIALE GG CFVLSAN QFCRRKDYPS PPEYMFSGSE ESLTPDSVVC AGGSSIISPL GIVLAGPNYR GEALITADLD LGDIARAKFD FDV VGHYSR PEVFSLNIRE HPRKAVSFKT SKVMEDESVH HHHHH

UniProtKB: Bifunctional nitrilase/nitrile hydratase NIT4

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析らせん対称体再構成法
試料の集合状態filament

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試料調製

濃度0.15 mg/mL
緩衝液pH: 8
構成要素:
濃度式名称
200.0 mMNaClSodium chloride
50.0 mMTris-HclTris
グリッドモデル: Quantifoil, UltrAuFoil, R1.2/1.3 / 材質: GOLD / メッシュ: 400 / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE / 前処理 - 時間: 60 sec. / 前処理 - 雰囲気: AIR
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 50 % / チャンバー内温度: 293 K / 装置: FEI VITROBOT MARK I
詳細: The sample (2.5 ul) was applied to the grid and incubated for 30 seconds at 50% humidity before blotting and plunging..

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k)
検出モード: COUNTING / デジタル化 - サイズ - 横: 3838 pixel / デジタル化 - サイズ - 縦: 3710 pixel / 撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 1266 / 平均露光時間: 7.0 sec. / 平均電子線量: 45.5 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.7 mm / 最大 デフォーカス（公称値）: 2.0 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.75 µm
試料ステージ試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER
ホルダー冷却材: NITROGEN
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

最終 再構成想定した対称性 - らせんパラメータ - Δz: 17.68 Å
想定した対称性 - らせんパラメータ - ΔΦ: -73.20 °
想定した対称性 - らせんパラメータ - 軸対称性: C1 (非対称)
アルゴリズム: BACK PROJECTION / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 3.9 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 2.0) / 使用した粒子像数: 33812
Segment selection選択した数: 133106 / 詳細: 3D class with a 73.2 degree average helical twist
初期モデルモデルのタイプ: EMDB MAP
EMDB ID:

3497


詳細: Low-pass filtered to 60 A
最終 角度割当タイプ: NOT APPLICABLE / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 2.0)
FSC曲線 (解像度の算出)

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原子モデル構築 1

詳細Ab initio fitting was performed using Buccaneer, cleaned up with Coot and Phenix Real-Space Refine.
精密化空間: REAL / プロトコル: AB INITIO MODEL
当てはまり具合の基準: Cross-correlation coefficient
得られたモデル

PDB-6i5u:
Cryo-EM informed directed evolution of Nitrilase 4 leads to a change in quaternary structure.

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbjlvh1.pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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