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- EMDB-39633: Cryo-EM structure of small and dead form SaCas9-RNA-DNA ternary c... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-39633
タイトルCryo-EM structure of small and dead form SaCas9-RNA-DNA ternary complex (sdCas9)
マップデータ
試料
  • 複合体: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex
    • タンパク質・ペプチド: sCas9 (Compact SaCas9)
    • RNA: sgRNA
    • DNA: Target DNA
    • DNA: Non-target DNA
キーワードCRISPR/Cas9 / Thermostable protein engineering / Domain minimized Cas / engineered SaCas9 / DNA BINDING PROTEIN
生物種Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌) / synthetic construct (人工物)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.97 Å
データ登録者Kang ES / Kim NH / Thach TT / Hyun J / Kim YH
資金援助 韓国, 2件
OrganizationGrant number国
National Research Foundation (NRF, Korea)NRF-2023R1A2C300573 韓国
National Research Foundation (NRF, Korea)RS-2023-00302458 韓国
引用ジャーナル: Adv Mater / 年: 2025
タイトル: Structure-Guided Engineering of Thermodynamically Enhanced SaCas9 for Improved Gene Suppression.
著者: Eun Sung Kang / Nam Hyeong Kim / Hyun-Kyoung Lim / Hyeyeon Jeon / Kayoung Han / Young Hyun No / Kyungtae Kim / Zinah Hilal Khaleel / Dongsun Shin / Kilho Eom / Jiyoung Nam / Bok-Soo Lee / Han- ...著者: Eun Sung Kang / Nam Hyeong Kim / Hyun-Kyoung Lim / Hyeyeon Jeon / Kayoung Han / Young Hyun No / Kyungtae Kim / Zinah Hilal Khaleel / Dongsun Shin / Kilho Eom / Jiyoung Nam / Bok-Soo Lee / Han-Joo Kim / Minah Suh / Jaecheol Lee / Trung Thanh Thach / Jaekyung Hyun / Yong Ho Kim /
要旨: Proteins with multiple domains play pivotal roles in various biological processes, necessitating a thorough understanding of their structural stability and functional interplay. Here, a structure- ...Proteins with multiple domains play pivotal roles in various biological processes, necessitating a thorough understanding of their structural stability and functional interplay. Here, a structure-guided protein engineering approach is proposed to develop thermostable Cas9 (CRISPR-associated protein 9) variant for CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) interference applications. By employing thermodynamic analysis, combining distance mapping and molecular dynamics simulations, deletable domains are identified to enhance stability while preserving the DNA recognition function of Cas9. The resulting engineered Cas9, termed small and dead form Cas9, exhibits improved thermostability and maintains target DNA recognition function. Cryo-electron microscopy analysis reveals structural integrity with reduced atomic density in the deleted domain. Fusion with functional elements enables intracellular delivery and nuclear localization, demonstrating efficient gene suppression in diverse cell types. Direct delivery in the mouse brain shows enhanced knockdown efficiency, highlighting the potential of structure-guided engineering to develop functional CRISPR systems tailored for specific applications. This study underscores the significance of integrating computational and experimental approaches for protein engineering, offering insights into designing tailored molecular tools for precise biological interventions.
履歴
登録2024年3月31日-
ヘッダ(付随情報) 公開2025年4月2日-
マップ公開2025年4月2日-
更新2025年7月16日-
現状2025年7月16日処理サイト: PDBj / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_39633.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_39633.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 64 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
0.98 Å/pix.
x 256 pix.
= 249.6 Å		0.98 Å/pix.
x 256 pix.
= 249.6 Å		0.98 Å/pix.
x 256 pix.
= 249.6 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.975 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.00164
最小 - 最大-0.035801042 - 0.061900724
平均 (標準偏差)0.00003269028 (±0.00092224835)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ256256256
Spacing256256256
セルA=B=C: 249.59999 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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ハーフマップ: #2

ファイルemd_39633_half_map_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: #1

ファイルemd_39633_half_map_2.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex

全体名称: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex
要素
  • 複合体: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex
    • タンパク質・ペプチド: sCas9 (Compact SaCas9)
    • RNA: sgRNA
    • DNA: Target DNA
    • DNA: Non-target DNA

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超分子 #1: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex

超分子名称: Cryo-EM structure of Compact SaCas9-RNA-DNA ternary complex
タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
分子量理論値: 106 KDa

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分子 #1: sCas9 (Compact SaCas9)

分子名称: sCas9 (Compact SaCas9) / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
分子量理論値: 104.196102 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli (大腸菌)
配列文字列: MKRNYILGLA IGITSVGYGI IDYETRDVID AGVRLFKEAN VENNEGRRSK RGARRLKRRR RHRIQRVKKL LFDYNLLTDH SELSGINPY EARVKGLSQK LSEEEFSAAL LHLAKRRGVH NVNEVEEDTG NELSTKEQIS RNSKALEEKY VAELQLERLK K DGEVRGSI ...文字列:
MKRNYILGLA IGITSVGYGI IDYETRDVID AGVRLFKEAN VENNEGRRSK RGARRLKRRR RHRIQRVKKL LFDYNLLTDH SELSGINPY EARVKGLSQK LSEEEFSAAL LHLAKRRGVH NVNEVEEDTG NELSTKEQIS RNSKALEEKY VAELQLERLK K DGEVRGSI NRFKTSDYVK EAKQLLKVQK AYHQLDQSFI DTYIDLLETR RTYYEGPGEG SPFGWKDIKE WYEMLMGHCT YF PEELRSV KYAYNADLYN ALNDLNNLVI TRDENEKLEY YEKFQIIENV FKQKKKPTLK QIAKEILVNE EDIKGYRVTS TGK PEFTNL KVYHDIKDIT ARKEIIENAE LLDQIAKILT IYQSSEDIQE ELTNLNSELT QEEIEQISNL KGYTGTHNLS LKAI NLILD ELWHTNDNQI AIFNRLKLVP KKVDLSQQKE IPTTLVDDFI LSPVVKRSFI QSIKVINAII KKYGLPNDII IELAR GGSY ATRGLMNLLR SYFRVNNLDV KVKSINGGFT SFLRRKWKFK KERNKGYKHH AEDALIIANA DFIFKEWKKL DKAKKV MEN QMFEEKQAES MPEIETEQEY KEIFITPHQI KHIKDFKDYK YSHRVDKKPN RELINDTLYS TRKDDKGNTL IVNNLNG LY DKDNDKLKKL INKSPEKLLM YHHDPQTYQK LKLIMEQYGD EKNPLYKYYE ETGNYLTKYS KKDNGPVIKK IKYYGNKL N AHLDITDDYP NSRNKVVKLS LKPYRFDVYL DNGVYKFVTV KNLDVIKKEN YYEVNSKCYE EAKKLKKISN QAEFIASFY NNDLIKINGE LYRVIGVNND LLNRIEVNMI DITYREYLEN MNDKRPPRII KTIASKTQSI KKYSTDILGN LYEVKSKKHP QIIKKG

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分子 #2: sgRNA

分子名称: sgRNA / タイプ: rna / ID: 2 / コピー数: 1
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 31.483635 KDa
配列文字列:
GAUCUGAGUC CGGUAGCGCU AGUUUUAGUA CUCUGGAAAC AGAAUCUACU AAAACAAGGC AAAAUGCCGU GUUUAUCUCG UCAACUUGU UGGCGAGAU

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分子 #3: Target DNA

分子名称: Target DNA / タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 18.08358 KDa
配列文字列: (DG)(DA)(DA)(DC)(DC)(DG)(DT)(DC)(DA)(DG) (DA)(DT)(DC)(DC)(DG)(DC)(DT)(DA)(DG)(DC) (DG)(DC)(DT)(DA)(DC)(DC)(DG)(DG)(DA) (DC)(DT)(DC)(DA)(DG)(DA)(DT)(DC)(DT)(DC) (DG) (DA)(DG)(DT)(DT)(DC) ...文字列:
(DG)(DA)(DA)(DC)(DC)(DG)(DT)(DC)(DA)(DG) (DA)(DT)(DC)(DC)(DG)(DC)(DT)(DA)(DG)(DC) (DG)(DC)(DT)(DA)(DC)(DC)(DG)(DG)(DA) (DC)(DT)(DC)(DA)(DG)(DA)(DT)(DC)(DT)(DC) (DG) (DA)(DG)(DT)(DT)(DC)(DA)(DA)(DG) (DC)(DT)(DT)(DC)(DG)(DA)(DA)(DT)(DT)(DC) (DT)

GENBANK: GENBANK: U19277.1

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分子 #4: Non-target DNA

分子名称: Non-target DNA / タイプ: dna / ID: 4 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 18.283701 KDa
配列文字列: (DA)(DG)(DA)(DA)(DT)(DT)(DC)(DG)(DA)(DA) (DG)(DC)(DT)(DT)(DG)(DA)(DA)(DC)(DT)(DC) (DG)(DA)(DG)(DA)(DT)(DC)(DT)(DG)(DA) (DG)(DT)(DC)(DC)(DG)(DG)(DT)(DA)(DG)(DC) (DG) (DC)(DT)(DA)(DG)(DC) ...文字列:
(DA)(DG)(DA)(DA)(DT)(DT)(DC)(DG)(DA)(DA) (DG)(DC)(DT)(DT)(DG)(DA)(DA)(DC)(DT)(DC) (DG)(DA)(DG)(DA)(DT)(DC)(DT)(DG)(DA) (DG)(DT)(DC)(DC)(DG)(DG)(DT)(DA)(DG)(DC) (DG) (DC)(DT)(DA)(DG)(DC)(DG)(DG)(DA) (DT)(DC)(DT)(DG)(DA)(DC)(DG)(DG)(DT)(DT) (DC)

GENBANK: GENBANK: U19277.1

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

濃度0.6 mg/mL
緩衝液pH: 7.4 / 構成要素 - 濃度: 20.0 mM / 構成要素 - 式: Tris-HCl / 構成要素 - 名称: Tris, NaCl, MgCl buffer
詳細: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP
グリッドモデル: Quantifoil R1.2/1.3 / 材質: COPPER / メッシュ: 300 / 支持フィルム - 材質: CARBON / 支持フィルム - トポロジー: HOLEY / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE / 前処理 - 時間: 60 sec. / 詳細: -15 mA
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 95 % / チャンバー内温度: 277 K / 装置: FEI VITROBOT MARK IV
詳細Cas9: sgRNA: DNA ternary complex was generated by combining purified Cas9 protein, sgRNA, and dsDNA in molar ratios of 1:1.2:1.3, incubated at room temperature for 1 hour in 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP.

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
特殊光学系エネルギーフィルター - 名称: GIF Bioquantum
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k)
実像数: 50 / 平均露光時間: 19.24 sec. / 平均電子線量: 50.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系C2レンズ絞り径: 70.0 µm / 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 0.1 mm / 最大 デフォーカス（公称値）: 2.0 µm
最小 デフォーカス（公称値）: 0.7000000000000001 µm
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

粒子像選択選択した数: 1758133
CTF補正ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 5.0) / タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
初期モデルモデルのタイプ: PDB ENTRY
PDBモデル - PDB ID:

5axw


詳細: Crystal structure of Staphylococcus aureus Cas9 in complex with sgRNA and target DNA (TTGGGT PAM)
最終 再構成想定した対称性 - 点群: C1 (非対称) / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 2.97 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 5.0) / 使用した粒子像数: 162748
初期 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 5.0)
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 5.0)
最終 3次元分類クラス数: 50 / ソフトウェア - 名称: cryoSPARC (ver. 4.4.1)

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原子モデル構築 1

初期モデルPDB ID:

5axw


Chain - Chain ID: a / Chain - Residue range: 1-1053 / Chain - Source name: PDB / Chain - Initial model type: experimental model
詳細: The initial model generated from 5AXW without HNH and Linker domain
精密化プロトコル: AB INITIO MODEL
得られたモデル

PDB-8ywh:
Cryo-EM structure of small and dead form SaCas9-RNA-DNA ternary complex (sdCas9)

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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