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- EMDB-14501: SpCas9 bound to 18-nucleotide complementary DNA substrate in the ... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-14501
タイトルSpCas9 bound to 18-nucleotide complementary DNA substrate in the checkpoint state
マップデータ
試料
  • 複合体: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide complementary DNA substrate in the inactive state
    • RNA: sgRNA
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
    • DNA: Target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
    • DNA: Non-target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
  • リガンド: MAGNESIUM ION
  • リガンド: POTASSIUM ION
  • リガンド: water
キーワードCRISPR / Cas9 / R-loop / substrate binding / off-target / HYDROLASE
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9 RuvC domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain ...CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9 RuvC domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
類似検索 - 構成要素
生物種Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) / synthetic construct (人工物)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.54 Å
データ登録者Pacesa M / Jinek M
資金援助 スイス, 1件
OrganizationGrant number国
Swiss National Science Foundation31003A_182567 スイス
引用ジャーナル: Nature / 年: 2022
タイトル: R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9.
著者: Martin Pacesa / Luuk Loeff / Irma Querques / Lena M Muckenfuss / Marta Sawicka / Martin Jinek /
要旨: Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise ...Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise mechanisms of target DNA binding and off-target discrimination remain incompletely understood. Here we report a series of cryo-electron microscopy structures of Streptococcus pyogenes Cas9 capturing the directional process of target DNA hybridization. In the early phase of R-loop formation, the Cas9 REC2 and REC3 domains form a positively charged cleft that accommodates the distal end of the target DNA duplex. Guide-target hybridization past the seed region induces rearrangements of the REC2 and REC3 domains and relocation of the HNH nuclease domain to assume a catalytically incompetent checkpoint conformation. Completion of the guide-target heteroduplex triggers conformational activation of the HNH nuclease domain, enabled by distortion of the guide-target heteroduplex, and complementary REC2 and REC3 domain rearrangements. Together, these results establish a structural framework for target DNA-dependent activation of Cas9 that sheds light on its conformational checkpoint mechanism and may facilitate the development of novel Cas9 variants and guide RNA designs with enhanced specificity and activity.
履歴
登録2022年3月4日-
ヘッダ(付随情報) 公開2022年8月31日-
マップ公開2022年8月31日-
更新2024年7月17日-
現状2024年7月17日処理サイト: PDBe / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_14501.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_14501.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 488.4 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
投影像・断面図

画像のコントロール

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明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
0.45 Å/pix.
x 504 pix.
= 226.8 Å		0.45 Å/pix.
x 504 pix.
= 226.8 Å		0.45 Å/pix.
x 504 pix.
= 226.8 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

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ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.45 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.022
最小 - 最大-0.089672565 - 0.22747503
平均 (標準偏差)0.0009289633 (±0.0060837837)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ504504504
Spacing504504504
セルA=B=C: 226.79999 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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ハーフマップ: #2

ファイルemd_14501_half_map_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: #1

ファイルemd_14501_half_map_2.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide compleme...

全体名称: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide complementary DNA substrate in the inactive state
要素
  • 複合体: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide complementary DNA substrate in the inactive state
    • RNA: sgRNA
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
    • DNA: Target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
    • DNA: Non-target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
  • リガンド: MAGNESIUM ION
  • リガンド: POTASSIUM ION
  • リガンド: water

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超分子 #1: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide compleme...

超分子名称: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide complementary DNA substrate in the inactive state
タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: #1-#4
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)

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分子 #1: sgRNA

分子名称: sgRNA / タイプ: rna / ID: 1 / コピー数: 1
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 33.005641 KDa
配列文字列:
GGGACGCAUA AAGAUGAGAC GCGUUUUAGA GCUAGAAAUA GCAAGUUAAA AUAAGGCUAG UCCGUUAUCA ACUUGAAAAA GUGGCACCG AGUCGGUGCU UUU

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分子 #2: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

分子名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 2 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
EC番号: 加水分解酵素; エステル加水分解酵素
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 158.699844 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli (大腸菌)
配列文字列: MDKKYSIGLD IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNE MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA DLRLIYLALA H MIKFRGHF ...文字列:
MDKKYSIGLD IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNE MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA DLRLIYLALA H MIKFRGHF LIEGDLNPDN SDVDKLFIQL VQTYNQLFEE NPINASGVDA KAILSARLSK SRRLENLIAQ LPGEKKNGLF GN LIALSLG LTPNFKSNFD LAEDAKLQLS KDTYDDDLDN LLAQIGDQYA DLFLAAKNLS DAILLSDILR VNTEITKAPL SAS MIKRYD EHHQDLTLLK ALVRQQLPEK YKEIFFDQSK NGYAGYIDGG ASQEEFYKFI KPILEKMDGT EELLVKLNRE DLLR KQRTF DNGSIPHQIH LGELHAILRR QEDFYPFLKD NREKIEKILT FRIPYYVGPL ARGNSRFAWM TRKSEETITP WNFEE VVDK GASAQSFIER MTNFDKNLPN EKVLPKHSLL YEYFTVYNEL TKVKYVTEGM RKPAFLSGEQ KKAIVDLLFK TNRKVT VKQ LKEDYFKKIE CFDSVEISGV EDRFNASLGT YHDLLKIIKD KDFLDNEENE DILEDIVLTL TLFEDREMIE ERLKTYA HL FDDKVMKQLK RRRYTGWGRL SRKLINGIRD KQSGKTILDF LKSDGFANRN FMQLIHDDSL TFKEDIQKAQ VSGQGDSL H EHIANLAGSP AIKKGILQTV KVVDELVKVM GRHKPENIVI EMARENQTTQ KGQKNSRERM KRIEEGIKEL GSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDH IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNA KLITQRKFDN LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK S KLVSDFRK DFQFYKVREI NNYHHAHDAY LNAVVGTALI KKYPKLESEF VYGDYKVYDV RKMIAKSEQE IGKATAKYFF YS NIMNFFK TEITLANGEI RKRPLIETNG ETGEIVWDKG RDFATVRKVL SMPQVNIVKK TEVQTGGFSK ESILPKRNSD KLI ARKKDW DPKKYGGFDS PTVAYSVLVV AKVEKGKSKK LKSVKELLGI TIMERSSFEK NPIDFLEAKG YKEVKKDLII KLPK YSLFE LENGRKRMLA SAGELQKGNE LALPSKYVNF LYLASHYEKL KGSPEDNEQK QLFVEQHKHY LDEIIEQISE FSKRV ILAD ANLDKVLSAY NKHRDKPIRE QAENIIHLFT LTNLGAPAAF KYFDTTIDRK RYTSTKEVLD ATLIHQSITG LYETRI DLS QLGGD

UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

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分子 #3: Target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate

分子名称: Target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 11.643458 KDa
配列文字列:
(DC)(DG)(DT)(DG)(DA)(DT)(DT)(DC)(DC)(DA) (DG)(DC)(DG)(DT)(DC)(DT)(DC)(DA)(DT)(DC) (DT)(DT)(DT)(DA)(DT)(DG)(DC)(DG)(DA) (DG)(DT)(DG)(DT)(DA)(DC)(DT)(DC)(DG)

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分子 #4: Non-target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate

分子名称: Non-target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate
タイプ: dna / ID: 4 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 11.73455 KDa
配列文字列:
(DC)(DG)(DA)(DG)(DT)(DA)(DC)(DA)(DC)(DT) (DA)(DT)(DT)(DG)(DC)(DG)(DG)(DG)(DA)(DC) (DG)(DC)(DT)(DA)(DT)(DT)(DA)(DT)(DT) (DG)(DG)(DA)(DA)(DT)(DC)(DA)(DC)(DG)

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分子 #5: MAGNESIUM ION

分子名称: MAGNESIUM ION / タイプ: ligand / ID: 5 / コピー数: 1 / 式: MG
分子量理論値: 24.305 Da

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分子 #6: POTASSIUM ION

分子名称: POTASSIUM ION / タイプ: ligand / ID: 6 / コピー数: 2 / 式: K
分子量理論値: 39.098 Da

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分子 #7: water

分子名称: water / タイプ: ligand / ID: 7 / コピー数: 6 / 式: HOH
分子量理論値: 18.015 Da
Chemical component information

ChemComp-HOH:
WATER

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

緩衝液pH: 7.5
凍結凍結剤: ETHANE-PROPANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 293.15 K

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: FEI FALCON IV (4k x 4k)
平均電子線量: 60.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / Cs: 2.7 mm / 最大 デフォーカス（公称値）: 1.5 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.8 µm
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

初期モデルモデルのタイプ: PDB ENTRY
PDBモデル - PDB ID:

5fq5

最終 再構成解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 2.54 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 66518
初期 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
FSC曲線 (解像度の算出)

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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