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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 7z4j | ||||||
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タイトル | SpCas9 bound to 18-nucleotide complementary DNA substrate in the catalytic state | ||||||
要素 |
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キーワード | HYDROLASE / CRISPR / Cas9 / R-loop / substrate binding / off-target | ||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||
生物種 | Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) synthetic construct (人工物) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.99 Å | ||||||
データ登録者 | Pacesa, M. / Jinek, M. | ||||||
資金援助 | スイス, 1件
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引用 | ジャーナル: Nature / 年: 2022 タイトル: R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9. 著者: Martin Pacesa / Luuk Loeff / Irma Querques / Lena M Muckenfuss / Marta Sawicka / Martin Jinek / 要旨: Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise ...Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise mechanisms of target DNA binding and off-target discrimination remain incompletely understood. Here we report a series of cryo-electron microscopy structures of Streptococcus pyogenes Cas9 capturing the directional process of target DNA hybridization. In the early phase of R-loop formation, the Cas9 REC2 and REC3 domains form a positively charged cleft that accommodates the distal end of the target DNA duplex. Guide-target hybridization past the seed region induces rearrangements of the REC2 and REC3 domains and relocation of the HNH nuclease domain to assume a catalytically incompetent checkpoint conformation. Completion of the guide-target heteroduplex triggers conformational activation of the HNH nuclease domain, enabled by distortion of the guide-target heteroduplex, and complementary REC2 and REC3 domain rearrangements. Together, these results establish a structural framework for target DNA-dependent activation of Cas9 that sheds light on its conformational checkpoint mechanism and may facilitate the development of novel Cas9 variants and guide RNA designs with enhanced specificity and activity. | ||||||
履歴 |
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-構造の表示
構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
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-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 7z4j.cif.gz | 364.8 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb7z4j.ent.gz | 281.4 KB | 表示 | PDB形式 |
PDBx/mmJSON形式 | 7z4j.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 7z4j_validation.pdf.gz | 1.5 MB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 7z4j_full_validation.pdf.gz | 1.5 MB | 表示 | |
XML形式データ | 7z4j_validation.xml.gz | 55.3 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 7z4j_validation.cif.gz | 83.4 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/z4/7z4j ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/z4/7z4j | HTTPS FTP |
-関連構造データ
関連構造データ | 14499MC 7z4cC 7z4dC 7z4eC 7z4gC 7z4hC 7z4iC 7z4kC 7z4lC M: このデータのモデリングに利用したマップデータ C: 同じ文献を引用 (文献) |
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類似構造データ | 類似検索 - 機能・相同性F&H 検索 |
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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1 |
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-要素
-Target strand of 18-nucleotide complementary DNA substrate, PAM- ... , 2種, 2分子 cC
#2: DNA鎖 | 分子量: 3967.585 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
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#3: DNA鎖 | 分子量: 9780.272 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
-RNA鎖 / DNA鎖 / タンパク質 , 3種, 3分子 ADB
#1: RNA鎖 | 分子量: 33005.641 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
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#4: DNA鎖 | 分子量: 13567.769 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
#5: タンパク質 | 分子量: 158699.844 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) 遺伝子: cas9, csn1, SPy_1046 / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) 参照: UniProt: Q99ZW2, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 |
-非ポリマー , 2種, 12分子
#6: 化合物 | ChemComp-MG / #7: 水 | ChemComp-HOH / | |
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-詳細
研究の焦点であるリガンドがあるか | N |
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-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 | 名称: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 18-nucleotide complementary DNA substrate in the catalytic state タイプ: COMPLEX / Entity ID: #1-#5 / 由来: MULTIPLE SOURCES |
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分子量 | 実験値: NO |
由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
由来(組換発現) | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
緩衝液 | pH: 7.5 |
試料 | 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES |
急速凍結 | 凍結剤: ETHANE-PROPANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 293.15 K |
-電子顕微鏡撮影
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス(公称値): 2400 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 1000 nm / Cs: 2.7 mm |
撮影 | 電子線照射量: 64.2 e/Å2 / フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) |
-解析
ソフトウェア | 名称: PHENIX / バージョン: 1.20.1_4487: / 分類: 精密化 |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION |
3次元再構成 | 解像度: 2.99 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 68772 / 対称性のタイプ: POINT |