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基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 7vw3 | |||||||||
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タイトル | Cryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex | |||||||||
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![]() | DNA BINDING PROTEIN/RNA/DNA / CRISPR-Cas9 / genome editing / DNA cleavage / DNA BINDING PROTEIN / DNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex | |||||||||
機能・相同性 | ![]() maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | |||||||||
生物種 | ![]() ![]() synthetic construct (人工物) | |||||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.8 Å | |||||||||
![]() | Du, W.H. / Qian, J.Q. / Huang, Q. | |||||||||
資金援助 | ![]()
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![]() | ![]() タイトル: Full-Length Model of SaCas9-sgRNA-DNA Complex in Cleavage State. 著者: Wenhao Du / Haixia Zhu / Jiaqiang Qian / Dongmei Xue / Sen Zheng / Qiang Huang / ![]() 要旨: Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined ... Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined the first cryo-electron microscopy structure of the SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex. This structure reveals that the HNH nuclease domain is tightly bound to the cleavage site of the target DNA strand, and is in close contact with the WED and REC domains. Moreover, it captures the complete structure of the sgRNA, including the previously unresolved stem-loop 2. Based on this structure, we build a full-length model for the ternary complex in cleavage state. This model enables identification of the residues for the interactions between the HNH domain and the WED and REC domains. Moreover, we found that the stem-loop 2 of the sgRNA tightly binds to the PI and RuvC domains and may also regulate the position shift of the RuvC domain. Further mutagenesis and molecular dynamics simulations supported the idea that the interactions of the HNH domain with the WED and REC domains play an important role in the DNA cleavage. Thus, this study provides new mechanistic insights into the DNA cleavage of SaCas9 and is also useful for guiding the future engineering of SaCas9-mediated gene editing systems. | |||||||||
履歴 |
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構造の表示
構造ビューア | 分子: ![]() ![]() |
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ダウンロードとリンク
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ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | ![]() | 292 KB | 表示 | ![]() |
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PDB形式 | ![]() | 221.3 KB | 表示 | ![]() |
PDBx/mmJSON形式 | ![]() | ツリー表示 | ![]() | |
その他 | ![]() |
-検証レポート
アーカイブディレクトリ | ![]() ![]() | HTTPS FTP |
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-関連構造データ
関連構造データ | ![]() 32104MC M: このデータのモデリングに利用したマップデータ C: 同じ文献を引用 ( |
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類似構造データ | 類似検索 - 機能・相同性 ![]() |
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リンク
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集合体
登録構造単位 | ![]()
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1 |
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要素
#1: タンパク質 | 分子量: 123940.508 Da / 分子数: 1 / 変異: D10A N580A / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) ![]() ![]() 遺伝子: cas9 / 発現宿主: ![]() ![]() 参照: UniProt: J7RUA5, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 | ||
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#2: RNA鎖 | 分子量: 33217.531 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) | ||
#3: DNA鎖 | 分子量: 12372.006 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) | ||
#4: DNA鎖 | 分子量: 8582.533 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) | ||
#5: 化合物 | 研究の焦点であるリガンドがあるか | Y | |
-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
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試料調製
構成要素 |
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分子量 | 値: 0.198 MDa / 実験値: NO | |||||||||||||||||||||||||
由来(天然) | 生物種: ![]() ![]() | |||||||||||||||||||||||||
由来(組換発現) | 生物種: ![]() ![]() | |||||||||||||||||||||||||
緩衝液 | pH: 7.5 詳細: 20mM Tris-Cl (pH 7.5), 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT | |||||||||||||||||||||||||
緩衝液成分 |
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試料 | 濃度: 0.22 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES / 詳細: blot for 4 seconds before pluging | |||||||||||||||||||||||||
試料支持 | グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 200 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3 | |||||||||||||||||||||||||
急速凍結 | 装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 289 K |
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電子顕微鏡撮影
実験機器 | ![]() モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: ![]() |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 倍率(公称値): 105000 X / 最大 デフォーカス(公称値): 2600 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 1800 nm |
試料ホルダ | 凍結剤: NITROGEN |
撮影 | 電子線照射量: 38 e/Å2 フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k) 実像数: 10389 |
画像スキャン | 横: 5760 / 縦: 4096 |
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解析
ソフトウェア |
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EMソフトウェア |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||||||
粒子像の選択 | 選択した粒子像数: 3872337 詳細: We used the program PARSED developed in our previous study to pick the complex particles from the micrographs(Yao R, et al. Bioinformatics. 2020,36:1252-1259). | ||||||||||||||||||||||||||||
対称性 | 点対称性: C1 (非対称) | ||||||||||||||||||||||||||||
3次元再構成 | 解像度: 3.8 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 217173 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 | プロトコル: FLEXIBLE FIT / 空間: REAL / Target criteria: correlation coefficient | ||||||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 |
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精密化 | 交差検証法: NONE 立体化学のターゲット値: GeoStd + Monomer Library + CDL v1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||
原子変位パラメータ | Biso mean: 236.8 Å2 | ||||||||||||||||||||||||||||
拘束条件 |
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