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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 7rhz | ||||||
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タイトル | Heterodimer of Cre recombinase mutants D33A/A36V/R192A and R72E/L115D/R119D in complex with loxP DNA. | ||||||
要素 |
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キーワード | RECOMBINATION/DNA / Cre / recombinase / dimer / loxP / RECOMBINATION-DNA complex | ||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 | ||||||
生物種 | Escherichia phage P1 (ファージ) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 4.48 Å | ||||||
データ登録者 | Stachowski, K. / Foster, M.P. | ||||||
資金援助 | 米国, 1件
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引用 | ジャーナル: Nucleic Acids Res / 年: 2022 タイトル: Mechanisms of Cre recombinase synaptic complex assembly and activation illuminated by Cryo-EM. 著者: Kye Stachowski / Andrew S Norris / Devante Potter / Vicki H Wysocki / Mark P Foster / 要旨: Cre recombinase selectively recognizes DNA and prevents non-specific DNA cleavage through an orchestrated series of assembly intermediates. Cre recombines two loxP DNA sequences featuring a pair of ...Cre recombinase selectively recognizes DNA and prevents non-specific DNA cleavage through an orchestrated series of assembly intermediates. Cre recombines two loxP DNA sequences featuring a pair of palindromic recombinase binding elements and an asymmetric spacer region, by assembly of a tetrameric synaptic complex, cleavage of an opposing pair of strands, and formation of a Holliday junction intermediate. We used Cre and loxP variants to isolate the monomeric Cre-loxP (54 kDa), dimeric Cre2-loxP (110 kDa), and tetrameric Cre4-loxP2 assembly intermediates, and determined their structures using cryo-EM to resolutions of 3.9, 4.5 and 3.2 Å, respectively. Progressive and asymmetric bending of the spacer region along the assembly pathway enables formation of increasingly intimate interfaces between Cre protomers and illuminates the structural bases of biased loxP strand cleavage order and half-the-sites activity. Application of 3D variability analysis to the tetramer data reveals constrained conformational sampling along the pathway between protomer activation and Holliday junction isomerization. These findings underscore the importance of protein and DNA flexibility in Cre-mediated site selection, controlled activation of alternating protomers, the basis for biased strand cleavage order, and recombination efficiency. Such considerations may advance development of site-specific recombinases for use in gene editing applications. | ||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 7rhz.cif.gz | 280 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb7rhz.ent.gz | 219.6 KB | 表示 | PDB形式 |
PDBx/mmJSON形式 | 7rhz.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 7rhz_validation.pdf.gz | 1 MB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 7rhz_full_validation.pdf.gz | 1.1 MB | 表示 | |
XML形式データ | 7rhz_validation.xml.gz | 30.6 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 7rhz_validation.cif.gz | 44 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/rh/7rhz ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/rh/7rhz | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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1 |
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-要素
#1: タンパク質 | 分子量: 38493.094 Da / 分子数: 1 / 変異: D33A, A36V, R192A / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia phage P1 (ファージ) / 遺伝子: cre / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) / 参照: UniProt: P06956 |
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#2: タンパク質 | 分子量: 38526.906 Da / 分子数: 1 / 変異: R72E, L115D, R119D / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Escherichia phage P1 (ファージ) / 遺伝子: cre / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) / 参照: UniProt: P06956 |
#3: DNA鎖 | 分子量: 13491.689 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Escherichia phage P1 (ファージ) |
#4: DNA鎖 | 分子量: 13602.748 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) Escherichia phage P1 (ファージ) |
-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 | 名称: Heterodimer of Cre recombinase mutants D33A/A36V/R192A and R72E/L115D/R119D in complex with loxP DNA タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: MULTIPLE SOURCES | |||||||||||||||||||||||||
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分子量 | 値: 0.1005 MDa / 実験値: YES | |||||||||||||||||||||||||
由来(天然) | 生物種: Escherichia phage P1 (ファージ) | |||||||||||||||||||||||||
緩衝液 | pH: 7 詳細: Buffer was made fresh from solid reagents and filtered with a 0.22 um filter. | |||||||||||||||||||||||||
緩衝液成分 |
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試料 | 濃度: 5 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES | |||||||||||||||||||||||||
試料支持 | 詳細: 20 mA Pelco easiGLOW / グリッドの材料: GOLD / グリッドのサイズ: 300 divisions/in. / グリッドのタイプ: Quantifoil R1.2/1.3 | |||||||||||||||||||||||||
急速凍結 | 装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE-PROPANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 277 K |
-電子顕微鏡撮影
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: TFS KRIOS |
電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 倍率(公称値): 81000 X / 最大 デフォーカス(公称値): 3000 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 1000 nm / C2レンズ絞り径: 100 µm / アライメント法: ZEMLIN TABLEAU |
試料ホルダ | 凍結剤: NITROGEN 試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER 最高温度: 86 K / 最低温度: 86 K |
撮影 | 平均露光時間: 2 sec. / 電子線照射量: 60 e/Å2 フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k) 撮影したグリッド数: 1 / 実像数: 4306 / 詳細: 45 total frames |
電子光学装置 | エネルギーフィルター名称: GIF Bioquantum / エネルギーフィルタースリット幅: 15 eV 球面収差補正装置: Microscope was modified with a Cs corrector with two hexapoles. |
画像スキャン | 横: 5760 / 縦: 4096 |
-解析
EMソフトウェア |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
粒子像の選択 | 選択した粒子像数: 1277272 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3次元再構成 | 解像度: 4.48 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 256734 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 | B value: 150.3 / プロトコル: FLEXIBLE FIT / 空間: REAL / Target criteria: Correlation Coefficient | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 | PDB-ID: 2HOI PDB chain-ID: A / Accession code: 2HOI / Pdb chain residue range: 20-343 / Source name: PDB / タイプ: experimental model |