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-基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 5vzl | ||||||
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タイトル | cryo-EM structure of the Cas9-sgRNA-AcrIIA4 anti-CRISPR complex | ||||||
要素 |
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キーワード | Immune System/RNA / anti-CRISPR / Cas9 / CRISPR / gene editing / on-target / off-target / cryo-EM / Immune System-RNA complex | ||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 symbiont-mediated suppression of host CRISPR-cas system / maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||
生物種 | Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) unidentified phage (ファージ) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.9 Å | ||||||
データ登録者 | Jiang, F. / Liu, J.J. / Nogales, E. / Doudna, J.A. | ||||||
資金援助 | 米国, 1件
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引用 | ジャーナル: Sci Adv / 年: 2017 タイトル: Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. 著者: Jiyung Shin / Fuguo Jiang / Jun-Jie Liu / Nicolas L Bray / Benjamin J Rauch / Seung Hyun Baik / Eva Nogales / Joseph Bondy-Denomy / Jacob E Corn / Jennifer A Doudna / 要旨: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 gene editing technology is derived from a microbial adaptive immune system, where bacteriophages are often the intended target. ...CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 gene editing technology is derived from a microbial adaptive immune system, where bacteriophages are often the intended target. Natural inhibitors of CRISPR-Cas9 enable phages to evade immunity and show promise in controlling Cas9-mediated gene editing in human cells. However, the mechanism of CRISPR-Cas9 inhibition is not known, and the potential applications for Cas9 inhibitor proteins in mammalian cells have not been fully established. We show that the anti-CRISPR protein AcrIIA4 binds only to assembled Cas9-single-guide RNA (sgRNA) complexes and not to Cas9 protein alone. A 3.9 Å resolution cryo-electron microscopy structure of the Cas9-sgRNA-AcrIIA4 complex revealed that the surface of AcrIIA4 is highly acidic and binds with a 1:1 stoichiometry to a region of Cas9 that normally engages the DNA protospacer adjacent motif. Consistent with this binding mode, order-of-addition experiments showed that AcrIIA4 interferes with DNA recognition but has no effect on preformed Cas9-sgRNA-DNA complexes. Timed delivery of AcrIIA4 into human cells as either protein or expression plasmid allows on-target Cas9-mediated gene editing while reducing off-target edits. These results provide a mechanistic understanding of AcrIIA4 function and demonstrate that inhibitors can modulate the extent and outcomes of Cas9-mediated gene editing. | ||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | 分子: MolmilJmol/JSmol |
-ダウンロードとリンク
-ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | 5vzl.cif.gz | 326.5 KB | 表示 | PDBx/mmCIF形式 |
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PDB形式 | pdb5vzl.ent.gz | 251.5 KB | 表示 | PDB形式 |
PDBx/mmJSON形式 | 5vzl.json.gz | ツリー表示 | PDBx/mmJSON形式 | |
その他 | その他のダウンロード |
-検証レポート
文書・要旨 | 5vzl_validation.pdf.gz | 792.4 KB | 表示 | wwPDB検証レポート |
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文書・詳細版 | 5vzl_full_validation.pdf.gz | 814.9 KB | 表示 | |
XML形式データ | 5vzl_validation.xml.gz | 44.7 KB | 表示 | |
CIF形式データ | 5vzl_validation.cif.gz | 70.3 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/vz/5vzl ftp://data.pdbj.org/pub/pdb/validation_reports/vz/5vzl | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
-集合体
登録構造単位 |
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1 |
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-要素
#1: RNA鎖 | 分子量: 38292.645 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) 遺伝子: csn1, cas9, ERS445054_00848 / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) |
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#2: タンパク質 | 分子量: 158772.891 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes M1 GAS (化膿レンサ球菌) 遺伝子: csn1, cas9, ERS445054_00848 / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) 参照: UniProt: A0A0C6FZC2, UniProt: Q99ZW2*PLUS, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 |
#3: タンパク質 | 分子量: 10182.073 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) unidentified phage (ファージ) / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌) / 参照: UniProt: A0A2D0TCG7*PLUS |
-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
-試料調製
構成要素 |
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分子量 | 実験値: NO | ||||||||||||||||||||||||
由来(天然) |
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由来(組換発現) | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) | ||||||||||||||||||||||||
緩衝液 | pH: 8 | ||||||||||||||||||||||||
試料 | 濃度: 1.25 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES / 詳細: spyCas9, sgRNA and AcrIIA4 complex | ||||||||||||||||||||||||
試料支持 | グリッドの材料: COPPER / グリッドのサイズ: 400 divisions/in. / グリッドのタイプ: C-flat-2/2 | ||||||||||||||||||||||||
急速凍結 | 装置: FEI VITROBOT MARK IV / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 281 K 詳細: blot for 4.5 seconds with force of 12 before plunging |
-電子顕微鏡撮影
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス(公称値): 3000 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 1000 nm / Calibrated defocus min: 900 nm / 最大 デフォーカス(補正後): 4000 nm / Cs: 0.01 mm / C2レンズ絞り径: 100 µm |
撮影 | 電子線照射量: 46 e/Å2 / 検出モード: SUPER-RESOLUTION フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k) |
-解析
ソフトウェア | 名称: PHENIX / バージョン: 1.11.1_2575: / 分類: 精密化 | ||||||||||||||||||||||||
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EMソフトウェア |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION | ||||||||||||||||||||||||
3次元再構成 | 解像度: 3.9 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 185000 / 対称性のタイプ: POINT | ||||||||||||||||||||||||
原子モデル構築 |
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拘束条件 |
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