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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-31721 | |||||||||
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タイトル | Cryo-EM structure of spyCas9-sgRNA-DNA dimer | |||||||||
マップデータ | Cas9 dimer | |||||||||
試料 |
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キーワード | Complex / RNA BINDING PROTEIN / RNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex | |||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | |||||||||
生物種 | Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) / Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌) | |||||||||
手法 | 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 5.26 Å | |||||||||
データ登録者 | Liu J / Deng P | |||||||||
資金援助 | 中国, 2件
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引用 | ジャーナル: Chem Sci / 年: 2021 タイトル: Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search. 著者: Mengyi Yang / Ruirui Sun / Pujuan Deng / Yuzhuo Yang / Wenjuan Wang / Jun-Jie Gogo Liu / Chunlai Chen / 要旨: RNA-guided Cas9 (SpCas9) is a sequence-specific DNA endonuclease that works as one of the most powerful genetic editing tools. However, how Cas9 locates its target among huge amounts of dsDNAs ...RNA-guided Cas9 (SpCas9) is a sequence-specific DNA endonuclease that works as one of the most powerful genetic editing tools. However, how Cas9 locates its target among huge amounts of dsDNAs remains elusive. Here, combining biochemical and single-molecule fluorescence assays, we revealed that Cas9 uses both three-dimensional and one-dimensional diffusion to find its target with high efficiency. We further observed surprising apparent asymmetric target search regions flanking PAM sites on dsDNA under physiological salt conditions, which accelerates the target search efficiency of Cas9 by ∼10-fold. Illustrated by a cryo-EM structure of the Cas9/sgRNA/dsDNA dimer, non-specific interactions between DNA ∼8 bp downstream of the PAM site and lysines within residues 1151-1156 of Cas9, especially lys1153, are the key elements to mediate the one-dimensional diffusion of Cas9 and cause asymmetric target search regions flanking the PAM. Disrupting these non-specific interactions, such as mutating these lysines to alanines, diminishes the contribution of one-dimensional diffusion and reduces the target search rate by several times. In addition, low ionic concentrations or mutations on PAM recognition residues that modulate interactions between Cas9 and dsDNA alter apparent asymmetric target search behaviors. Together, our results reveal a unique searching mechanism of Cas9 under physiological salt conditions, and provide important guidance for both and applications of Cas9. | |||||||||
履歴 |
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-構造の表示
添付画像 |
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-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_31721.map.gz | 117.4 MB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-31721-v30.xml emd-31721.xml | 12.2 KB 12.2 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
画像 | emd_31721.png | 72.3 KB | ||
Filedesc metadata | emd-31721.cif.gz | 6.3 KB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-31721 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-31721 | HTTPS FTP |
-検証レポート
文書・要旨 | emd_31721_validation.pdf.gz | 478.3 KB | 表示 | EMDB検証レポート |
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文書・詳細版 | emd_31721_full_validation.pdf.gz | 477.9 KB | 表示 | |
XML形式データ | emd_31721_validation.xml.gz | 6.8 KB | 表示 | |
CIF形式データ | emd_31721_validation.cif.gz | 7.7 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | https://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-31721 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/validation_reports/EMD-31721 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
関連構造データ | 7v59MC M: このマップから作成された原子モデル C: 同じ文献を引用 (文献) |
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類似構造データ | 類似検索 - 機能・相同性F&H 検索 |
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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「今月の分子」の関連する項目 |
-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_31721.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 125 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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注釈 | Cas9 dimer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
投影像・断面図 | 画像のコントロール
画像は Spider により作成 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 1.14 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
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-添付データ
-試料の構成要素
-全体 : Ternary complex of spyCas9 with sgRNA and DNA
全体 | 名称: Ternary complex of spyCas9 with sgRNA and DNA |
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要素 |
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-超分子 #1: Ternary complex of spyCas9 with sgRNA and DNA
超分子 | 名称: Ternary complex of spyCas9 with sgRNA and DNA / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
-分子 #1: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
分子 | 名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 2 / 光学異性体: LEVO EC番号: 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌) |
分子量 | 理論値: 158.111234 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli (大腸菌) |
配列 | 文字列: KKYSIGLDIG TNSVGWAVIT DEYKVPSKKF KVLGNTDRHS IKKNLIGALL FDSGETAEAT RLKRTARRRY TRRKNRICYL QEIFSNEMA KVDDSFFHRL EESFLVEEDK KHERHPIFGN IVDEVAYHEK YPTIYHLRKK LVDSTDKADL RLIYLALAHM I KFRGHFLI ...文字列: KKYSIGLDIG TNSVGWAVIT DEYKVPSKKF KVLGNTDRHS IKKNLIGALL FDSGETAEAT RLKRTARRRY TRRKNRICYL QEIFSNEMA KVDDSFFHRL EESFLVEEDK KHERHPIFGN IVDEVAYHEK YPTIYHLRKK LVDSTDKADL RLIYLALAHM I KFRGHFLI EGDLNPDNSD VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN LI ALSLGLT PNFKSNFDLA EDAKLQLSKD TYDDDLDNLL AQIGDQYADL FLAAKNLSDA ILLSDILRVN TEITKAPLSA SMI KRYDEH HQDLTLLKAL VRQQLPEKYK EIFFDQSKNG YAGYIDGGAS QEEFYKFIKP ILEKMDGTEE LLVKLNREDL LRKQ RTFDN GSIPHQIHLG ELHAILRRQE DFYPFLKDNR EKIEKILTFR IPYYVGPLAR GNSRFAWMTR KSEETITPWN FEEVV DKGA SAQSFIERMT NFDKNLPNEK VLPKHSLLYE YFTVYNELTK VKYVTEGMRK PAFLSGEQKK AIVDLLFKTN RKVTVK QLK EDYFKKIECF DSVEISGVED RFNASLGTYH DLLKIIKDKD FLDNEENEDI LEDIVLTLTL FEDREMIEER LKTYAHL FD DKVMKQLKRR RYTGWGRLSR KLINGIRDKQ SGKTILDFLK SDGFANRNFM QLIHDDSLTF KEDIQKAQVS GQGDSLHE H IANLAGSPAI KKGILQTVKV VDELVKVMGR HKPENIVIEM ARENQTTQKG QKNSRERMKR IEEGIKELGS QILKEHPVE NTQLQNEKLY LYYLQNGRDM YVDQELDINR LSDYDVDHIV PQSFLKDDSI DNKVLTRSDK NRGKSDNVPS EEVVKKMKNY WRQLLNAKL ITQRKFDNLT KAERGGLSEL DKAGFIKRQL VETRQITKHV AQILDSRMNT KYDENDKLIR EVKVITLKSK L VSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NI MNFFKTE ITLANGEIRK RPLIETNGET GEIVWDKGRD FATVRKVLSM PQVNIVKKTE VQTGGFSKES ILPKRNSDKL IAR KKDWDP KKYGGFDSPT VAYSVLVVAK VEKGKSKKLK SVKELLGITI MERSSFEKNP IDFLEAKGYK EVKKDLIIKL PKYS LFELE NGRKRMLASA GELQKGNELA LPSKYVNFLY LASHYEKLKG SPEDNEQKQL FVEQHKHYLD EIIEQISEFS KRVIL ADAN LDKVLSAYNK HRDKPIREQA ENIIHLFTLT NLGAPAAFKY FDTTIDRKRY TSTKEVLDAT LIHQSITGLY ETRIDL SQ UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 |
-分子 #2: RNA (115-MER)
分子 | 名称: RNA (115-MER) / タイプ: rna / ID: 2 / コピー数: 2 |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
分子量 | 理論値: 37.13709 KDa |
配列 | 文字列: GCGCAUAAAG AUGAGACGCG UUUUAGAGCU AUGCUGUUUU GAAAAAAACA GCAUAGCAAG UUAAAAUAAG GCUAGUCCGU UAUCAACUU GAAAAAGUGG CACCGAGUCG GUGCUU |
-分子 #3: DNA (49-MER)
分子 | 名称: DNA (49-MER) / タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 2 / 分類: DNA |
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由来(天然) | 生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) |
分子量 | 理論値: 15.040633 KDa |
配列 | 文字列: (DA)(DT)(DG)(DA)(DG)(DA)(DC)(DG)(DC)(DT) (DG)(DG)(DC)(DG)(DA)(DT)(DT)(DA)(DG)(DC) (DT)(DA)(DA)(DT)(DC)(DG)(DC)(DC)(DA) (DG)(DC)(DG)(DT)(DC)(DT)(DC)(DA)(DT)(DC) (DT) (DT)(DT)(DA)(DT)(DG)(DC)(DG)(DC) (DC) |
-実験情報
-構造解析
手法 | クライオ電子顕微鏡法 |
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解析 | 単粒子再構成法 |
試料の集合状態 | particle |
-試料調製
緩衝液 | pH: 7.5 |
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凍結 | 凍結剤: ETHANE |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | FEI TITAN KRIOS |
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撮影 | フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) / 平均電子線量: 53.0 e/Å2 |
電子線 | 加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD |
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
-画像解析
初期モデル | モデルのタイプ: PDB ENTRY PDBモデル - PDB ID: |
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最終 再構成 | 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 5.26 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 150080 |
初期 角度割当 | タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD |
最終 角度割当 | タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD |