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- PDB-8wus: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (termination) -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 8wus
タイトルSpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (termination)
要素
  • CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
  • DNA (40-MER)
  • DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')
  • DNA (51-MER)
  • Gag-Pol polyprotein
  • RNA (115-MER)
キーワードRNA BINDING PROTEIN/RNA/DNA / CRISPR-Cas / RNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


host cell late endosome membrane / maintenance of CRISPR repeat elements / virion assembly / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / host multivesicular body / DNA integration / viral genome integration into host DNA / establishment of integrated proviral latency / RNA-directed DNA polymerase activity ...host cell late endosome membrane / maintenance of CRISPR repeat elements / virion assembly / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / host multivesicular body / DNA integration / viral genome integration into host DNA / establishment of integrated proviral latency / RNA-directed DNA polymerase activity / RNA-DNA hybrid ribonuclease activity / defense response to virus / DNA recombination / structural constituent of virion / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / aspartic-type endopeptidase activity / DNA-directed DNA polymerase activity / symbiont entry into host cell / host cell plasma membrane / proteolysis / DNA binding / RNA binding / zinc ion binding / metal ion binding / plasma membrane
類似検索 - 分子機能
Gag-Pol polyprotein, Zinc-finger like domain / Murine leukemia virus integrase, C-terminal / Zinc-finger like, probable DNA-binding / Murine leukemia virus (MLV) integrase (IN) C-terminal domain / Gamma-retroviral matrix protein / Gag polyprotein, inner coat protein p12 / Core shell protein Gag P30 / : / Matrix protein (MA), p15 / Gag polyprotein, inner coat protein p12 ...Gag-Pol polyprotein, Zinc-finger like domain / Murine leukemia virus integrase, C-terminal / Zinc-finger like, probable DNA-binding / Murine leukemia virus (MLV) integrase (IN) C-terminal domain / Gamma-retroviral matrix protein / Gag polyprotein, inner coat protein p12 / Core shell protein Gag P30 / : / Matrix protein (MA), p15 / Gag polyprotein, inner coat protein p12 / Gag P30 core shell protein / Gamma-retroviral matrix domain superfamily / Reverse transcriptase/retrotransposon-derived protein, RNase H-like domain / RNase H-like domain found in reverse transcriptase / CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9 RuvC domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / RNase H / Integrase core domain / Integrase, catalytic core / Integrase catalytic domain profile. / RNase H type-1 domain profile. / Ribonuclease H domain / Reverse transcriptase domain / Reverse transcriptase (RT) catalytic domain profile. / Retropepsins / Retroviral aspartyl protease / Aspartyl protease, retroviral-type family profile. / Peptidase A2A, retrovirus, catalytic / Reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) / Retroviral matrix protein / Retrovirus capsid, N-terminal / zinc finger / Zinc knuckle / Zinc finger, CCHC-type superfamily / Zinc finger, CCHC-type / Zinc finger CCHC-type profile. / Aspartic peptidase, active site / Eukaryotic and viral aspartyl proteases active site. / Ribonuclease H superfamily / Aspartic peptidase domain superfamily / Ribonuclease H-like superfamily / Reverse transcriptase/Diguanylate cyclase domain / DNA/RNA polymerase superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
DNA / DNA (> 10) / RNA / RNA (> 10) / RNA (> 100) / Gag-Pol polyprotein / CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
類似検索 - 構成要素
生物種Moloney murine leukemia virus (ウイルス)
Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.9 Å
データ登録者Shuto, Y. / Nakagawa, R. / Hoki, M. / Omura, S.N. / Hirano, H. / Itoh, Y. / Nureki, O.
資金援助 日本, 1件
組織認可番号国
Japan Agency for Medical Research and Development (AMED)JP23ama121012 日本
引用ジャーナル: Nature / 年: 2024
タイトル: Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor.
著者: Yutaro Shuto / Ryoya Nakagawa / Shiyou Zhu / Mizuki Hoki / Satoshi N Omura / Hisato Hirano / Yuzuru Itoh / Feng Zhang / Osamu Nureki /
要旨: The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing ...The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing guide RNA (pegRNA) to facilitate a wide variety of precise genome edits in living cells. However, owing to a lack of structural information, the molecular mechanism of pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor remains poorly understood. Here we present cryo-electron microscopy structures of the SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA complex in multiple states. The termination structure, along with our functional analysis, reveals that M-MLV RT extends reverse transcription beyond the expected site, resulting in scaffold-derived incorporations that cause undesired edits at the target loci. Furthermore, structural comparisons among the pre-initiation, initiation and elongation states show that M-MLV RT remains in a consistent position relative to SpCas9 during reverse transcription, whereas the pegRNA-synthesized DNA heteroduplex builds up along the surface of SpCas9. On the basis of our structural insights, we rationally engineered pegRNA variants and prime-editor variants in which M-MLV RT is fused within SpCas9. Collectively, our findings provide structural insights into the stepwise mechanism of prime editing, and will pave the way for the development of a versatile prime editing toolbox.
履歴
登録2023年10月21日登録サイト: PDBJ / 処理サイト: PDBJ
改定 1.02024年6月5日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12024年6月12日Group: Data collection / Database references / Structure summary
カテゴリ: audit_author / citation ...audit_author / citation / citation_author / em_author_list
Item: _audit_author.name / _citation.pdbx_database_id_PubMed ..._audit_author.name / _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title / _citation_author.identifier_ORCID / _em_author_list.author
改定 1.22024年7月17日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / em_admin
Item: _citation.journal_volume / _citation.page_first ..._citation.journal_volume / _citation.page_first / _citation.page_last / _em_admin.last_update
改定 1.32024年9月4日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / em_admin
Item: _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title / _em_admin.last_update
改定 1.42024年9月11日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / em_admin
Item: _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title / _em_admin.last_update

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
E: Gag-Pol polyprotein
A: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
C: DNA (51-MER)
D: DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')
B: RNA (115-MER)
F: DNA (40-MER)


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)284,4236
ポリマ－284,4236
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
  • 根拠: 電子顕微鏡法, not applicable
タイプ名称対称操作数
identity operation1_555x,y,z1

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要素

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タンパク質 , 2種, 2分子 EA

#1: タンパク質 Gag-Pol polyprotein


分子量: 55656.242 Da / 分子数: 1 / 変異: D200N, D209N, T306K, W313F, T330P, D335N / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Moloney murine leukemia virus (ウイルス)
遺伝子: gag-pro-pol
発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
参照: UniProt: Q8UN00
#2: タンパク質 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1


分子量: 158457.578 Da / 分子数: 1 / 変異: H10A, H840A / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
遺伝子: cas9
発現宿主: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
参照: UniProt: Q99ZW2

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DNA鎖 , 3種, 3分子 CDF

#3: DNA鎖 DNA (51-MER)


分子量: 15636.033 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
#4: DNA鎖 DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')


分子量: 5291.446 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
#6: DNA鎖 DNA (40-MER)


分子量: 12315.929 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)

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RNA鎖 , 1種, 1分子 B

#5: RNA鎖 RNA (115-MER)


分子量: 37065.949 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
発現宿主: Teseptimavirus (ウイルス)

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詳細

研究の焦点であるリガンドがあるかN

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素名称: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex / タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT
分子量実験値: NO
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
緩衝液pH: 8
試料包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
急速凍結凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 297 K

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 1600 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 800 nm
撮影電子線照射量: 50 e/Å2 / フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k)

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解析

CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
3次元再構成解像度: 2.9 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 248187 / 対称性のタイプ: POINT
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.00319132
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d0.43526711
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d15.1814058
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.0353059
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.0032719

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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