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- EMDB-42837: Cryo-EM structure of GeoCas9 in complex with sgRNA and target DNA -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-42837
タイトルCryo-EM structure of GeoCas9 in complex with sgRNA and target DNA
マップデータSharp map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.
試料
  • 複合体: Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and target DNA
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9
    • RNA: sgRNA (107-MER)
    • DNA: Target strand DNA
    • DNA: Non-target strand DNA
キーワードRNA-guided DNA endonuclease / ternary complex / CRISPR / hydrolase / HYDROLASE-RNA-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
Cas9, alpha-helical lobe domain / Cas9 alpha-helical lobe domain / RuvC endonuclease subdomain 3 / RuvC endonuclease subdomain 3 / HNH endonuclease / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9
類似検索 - 構成要素
生物種Geobacillus stearothermophilus (バクテリア) / Mus musculus (ハツカネズミ)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.17 Å
データ登録者Eggers AR / Soczek KM / Tuck OT / Doudna JA
資金援助 米国, 1件
OrganizationGrant number国
National Institutes of Health/National Institute Of Allergy and Infectious Diseases (NIH/NIAID)AI171110 米国
引用ジャーナル: Cell / 年: 2024
タイトル: Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9.
著者: Amy R Eggers / Kai Chen / Katarzyna M Soczek / Owen T Tuck / Erin E Doherty / Bryant Xu / Marena I Trinidad / Brittney W Thornton / Peter H Yoon / Jennifer A Doudna /
要旨: Thermostable clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas9) enzymes could improve genome-editing efficiency and delivery due to extended protein ...Thermostable clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas9) enzymes could improve genome-editing efficiency and delivery due to extended protein lifetimes. However, initial experimentation demonstrated Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9) to be virtually inactive when used in cultured human cells. Laboratory-evolved variants of GeoCas9 overcome this natural limitation by acquiring mutations in the wedge (WED) domain that produce >100-fold-higher genome-editing levels. Cryoelectron microscopy (cryo-EM) structures of the wild-type and improved GeoCas9 (iGeoCas9) enzymes reveal extended contacts between the WED domain of iGeoCas9 and DNA substrates. Biochemical analysis shows that iGeoCas9 accelerates DNA unwinding to capture substrates under the magnesium-restricted conditions typical of mammalian but not bacterial cells. These findings enabled rational engineering of other Cas9 orthologs to enhance genome-editing levels, pointing to a general strategy for editing enzyme improvement. Together, these results uncover a new role for the Cas9 WED domain in DNA unwinding and demonstrate how accelerated target unwinding dramatically improves Cas9-induced genome-editing activity.
履歴
登録2023年11月14日-
ヘッダ(付随情報) 公開2024年5月29日-
マップ公開2024年5月29日-
更新2024年7月3日-
現状2024年7月3日処理サイト: RCSB / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_42837.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_42837.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 64 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
注釈Sharp map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
0.93 Å/pix.
x 256 pix.
= 238.08 Å		0.93 Å/pix.
x 256 pix.
= 238.08 Å		0.93 Å/pix.
x 256 pix.
= 238.08 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.93 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.27
最小 - 最大-1.0659535 - 1.9135756
平均 (標準偏差)-0.00069664506 (±0.05231394)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ256256256
Spacing256256256
セルA=B=C: 238.08 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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マスク #1

ファイルemd_42837_msk_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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追加マップ: Map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.

ファイルemd_42837_additional_1.map
注釈Map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: Half map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.

ファイルemd_42837_half_map_1.map
注釈Half map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: Half map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.

ファイルemd_42837_half_map_2.map
注釈Half map of deactivated WT-GeoCas9 with sgRNA and target DNA.
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and t...

全体名称: Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and target DNA
要素
  • 複合体: Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and target DNA
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9
    • RNA: sgRNA (107-MER)
    • DNA: Target strand DNA
    • DNA: Non-target strand DNA

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超分子 #1: Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and t...

超分子名称: Ternary complex of deactivated wild type GeoCas9 with sgRNA and target DNA
タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: all
由来(天然)生物種: Geobacillus stearothermophilus (バクテリア)
分子量理論値: 203 KDa

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分子 #1: CRISPR-associated endonuclease Cas9

分子名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Geobacillus stearothermophilus (バクテリア)
分子量理論値: 127.043883 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
配列文字列: MRYKIGLAIG ITSVGWAVMN LDIPRIEDLG VRIFDRAENP QTGESLALPR RLARSARRRL RRRKHRLERI RRLVIREGIL TKEELDKLF EEKHEIDVWQ LRVEALDRKL NNDELARVLL HLAKRRGFKS NRKSERSNKE NSTMLKHIEE NRAILSSYRT V GEMIVKDP ...文字列:
MRYKIGLAIG ITSVGWAVMN LDIPRIEDLG VRIFDRAENP QTGESLALPR RLARSARRRL RRRKHRLERI RRLVIREGIL TKEELDKLF EEKHEIDVWQ LRVEALDRKL NNDELARVLL HLAKRRGFKS NRKSERSNKE NSTMLKHIEE NRAILSSYRT V GEMIVKDP KFALHKRNKG ENYTNTIARD DLEREIRLIF SKQREFGNMS CTEEFENEYI TIWASQRPVA SKDDIEKKVG FC TFEPKEK RAPKATYTFQ SFIAWEHINK LRLISPSGAR GLTDEERRLL YEQAFQKNKI TYHDIRTLLH LPDDTYFKGI VYD RGESRK QNENIRFLEL DAYHQIRKAV DKVYGKGKSS SFLPIDFDTF GYALTLFKDD ADIHSYLRNE YEQNGKRMPN LANK VYDNE LIEELLNLSF TKFGHLSLKA LRSILPYMEQ GEVYSSACER AGYTFTGPKK KQKTMLLPNI PPIANPVVMR ALTQA RKVV NAIIKKYGSP VSIHIELARD LSQTFDERRK TKKEQDENRK KNETAIRQLM EYGLTLNPTG HDIVKFKLWS EQNGRC AYS LQPIEIERLL EPGYVEVDAV IPYSRSLDDS YTNKVLVLTR ENREKGNRIP AEYLGVGTER WQQFETFVLT NKQFSKK KR DRLLRLHYDE NEETEFKNRN LNDTRYISRF FANFIREHLK FAESDDKQKV YTVNGRVTAH LRSRWEFNKN REESDLHH A VDAVIVACTT PSDIAKVTAF YQRREQNKEL AKKTEPHFPQ PWPHFADELR ARLSKHPKES IKALNLGNYD DQKLESLQP VFVSRMPKRS VTGAAHQETL RRYVGIDERS GKIQTVVKTK LSEIKLDASG HFPMYGKESD PRTYEAIRQR LLEHNNDPKK AFQEPLYKP KKNGEPGPVI RTVKIIDTKN QVIPLNDGKT VAYNSNIVRV DVFEKDGKYY CVPVYTMDIM KGILPNKAIE P NKPYSEWK EMTEDYTFRF SLYPNDLIRI ELPREKTVKT AAGEEINVKD VFVYYKTIDS ANGGLELISH DHRFSLRGVG SR TLKRFEK YQVDVLGNIY KVRGEKRVGL ASSAHSKPGK TIRPLQSTRD

UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9

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分子 #2: sgRNA (107-MER)

分子名称: sgRNA (107-MER) / タイプ: rna / ID: 2 / コピー数: 1
由来(天然)生物種: Geobacillus stearothermophilus (バクテリア)
分子量理論値: 44.488117 KDa
配列文字列:
CACUGCAUUC UAGUUGUGGU UGUCAUAGUU CCCCUGAGAA AUCAGGGUUA CUAUGAUAAG GGCUUUCUGC CUAAGGCAGA CUGACCCGC GGCGUUGGGG AUCGCCUGUC GCCCGCUUUU GGCGGGCAUU CCCCAUCCUU

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分子 #3: Target strand DNA

分子名称: Target strand DNA / タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Mus musculus (ハツカネズミ)
分子量理論値: 15.797221 KDa
配列文字列: (DT)(DA)(DC)(DA)(DT)(DT)(DG)(DA)(DT)(DG) (DA)(DG)(DT)(DT)(DT)(DG)(DG)(DA)(DC)(DA) (DA)(DA)(DC)(DC)(DA)(DC)(DA)(DA)(DC) (DT)(DA)(DG)(DA)(DA)(DT)(DG)(DC)(DA)(DG) (DT) (DG)(DA)(DA)(DA)(DA) ...文字列:
(DT)(DA)(DC)(DA)(DT)(DT)(DG)(DA)(DT)(DG) (DA)(DG)(DT)(DT)(DT)(DG)(DG)(DA)(DC)(DA) (DA)(DA)(DC)(DC)(DA)(DC)(DA)(DA)(DC) (DT)(DA)(DG)(DA)(DA)(DT)(DG)(DC)(DA)(DG) (DT) (DG)(DA)(DA)(DA)(DA)(DA)(DA)(DA) (DT)(DG)(DC)

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分子 #4: Non-target strand DNA

分子名称: Non-target strand DNA / タイプ: dna / ID: 4 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Mus musculus (ハツカネズミ)
分子量理論値: 15.618021 KDa
配列文字列: (DG)(DC)(DA)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT) (DC)(DA)(DC)(DT)(DG)(DC)(DA)(DT)(DT)(DC) (DT)(DA)(DG)(DT)(DT)(DG)(DT)(DG)(DG) (DT)(DT)(DT)(DG)(DT)(DC)(DC)(DA)(DA)(DA) (DC) (DT)(DC)(DA)(DT)(DC) ...文字列:
(DG)(DC)(DA)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT)(DT) (DC)(DA)(DC)(DT)(DG)(DC)(DA)(DT)(DT)(DC) (DT)(DA)(DG)(DT)(DT)(DG)(DT)(DG)(DG) (DT)(DT)(DT)(DG)(DT)(DC)(DC)(DA)(DA)(DA) (DC) (DT)(DC)(DA)(DT)(DC)(DA)(DA)(DT) (DG)(DT)(DA)

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

緩衝液pH: 7.5
構成要素:
濃度式名称
20.0 mMC4H11NO3tris
100.0 mMKClpotassium chloride
1.0 mMC9H15O6PTCEP
0.25 %C3H8O3glycerol
グリッドモデル: Quantifoil R1.2/1.3 / 材質: GOLD / メッシュ: 300 / 支持フィルム - 材質: GOLD / 支持フィルム - トポロジー: HOLEY / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 281 K / 装置: FEI VITROBOT MARK IV

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TALOS ARCTICA
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) / 平均電子線量: 50.0 e/Å2
電子線加速電圧: 200 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: OTHER / 撮影モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2.0 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.8 µm
実験機器
モデル: Talos Arctica / 画像提供: FEI Company

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画像解析

初期モデルモデルのタイプ: OTHER / 詳細: cryoSPARC ab initio model
最終 再構成想定した対称性 - 点群: C1 (非対称) / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 3.17 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / ソフトウェア - 名称: cryoSPARC (ver. 4.2.1) / 使用した粒子像数: 117726
初期 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD / ソフトウェア - 名称: cryoSPARC (ver. 4.2.1)
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD / ソフトウェア - 名称: cryoSPARC (ver. 4.2.1)
最終 3次元分類ソフトウェア - 名称: cryoSPARC (ver. 4.2.1)
FSC曲線 (解像度の算出)

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原子モデル構築 1

初期モデル
Chain詳細
source_name: AlphaFold, initial_model_type: in silico modelv1.4.0
source_name: Other, initial_model_type: in silico modelModelAngelo v1.0.1
精密化空間: REAL / プロトコル: OTHER
得られたモデル

PDB-8uza:
Cryo-EM structure of GeoCas9 in complex with sgRNA and target DNA

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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