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- EMDB-37860: SpCas9-pegRNA-target DNA complex (pre-initiation) -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-37860
タイトルSpCas9-pegRNA-target DNA complex (pre-initiation)
マップデータ
試料
  • 複合体: SpCas9-pegRNA-target DNA complex
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
    • DNA: DNA (51-MER)
    • DNA: DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')
    • RNA: RNA (137-MER)
    • DNA: DNA (34-MER)
キーワードCRISPR-Cas / RNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. ...CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
類似検索 - 構成要素
生物種Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) / Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.2 Å
データ登録者Shuto Y / Nakagawa R / Hoki M / Omura SN / Hirano H / Itoh Y / Nureki O
資金援助 日本, 1件
OrganizationGrant number国
Japan Agency for Medical Research and Development (AMED)JP23ama121012 日本
引用ジャーナル: Nature / 年: 2024
タイトル: Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor.
著者: Yutaro Shuto / Ryoya Nakagawa / Shiyou Zhu / Mizuki Hoki / Satoshi N Omura / Hisato Hirano / Yuzuru Itoh / Feng Zhang / Osamu Nureki /
要旨: The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing ...The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing guide RNA (pegRNA) to facilitate a wide variety of precise genome edits in living cells. However, owing to a lack of structural information, the molecular mechanism of pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor remains poorly understood. Here we present cryo-electron microscopy structures of the SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA complex in multiple states. The termination structure, along with our functional analysis, reveals that M-MLV RT extends reverse transcription beyond the expected site, resulting in scaffold-derived incorporations that cause undesired edits at the target loci. Furthermore, structural comparisons among the pre-initiation, initiation and elongation states show that M-MLV RT remains in a consistent position relative to SpCas9 during reverse transcription, whereas the pegRNA-synthesized DNA heteroduplex builds up along the surface of SpCas9. On the basis of our structural insights, we rationally engineered pegRNA variants and prime-editor variants in which M-MLV RT is fused within SpCas9. Collectively, our findings provide structural insights into the stepwise mechanism of prime editing, and will pave the way for the development of a versatile prime editing toolbox.
履歴
登録2023年10月21日-
ヘッダ(付随情報) 公開2024年6月5日-
マップ公開2024年6月5日-
更新2024年6月12日-
現状2024年6月12日処理サイト: PDBj / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_37860.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_37860.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 10 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
ボクセルのサイズX=Y=Z: 1.2969 Å
密度
表面レベル登録者による: 0.27
最小 - 最大-0.49174947 - 2.3041177
平均 (標準偏差)-0.005649345 (±0.1690001)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin595959
サイズ138138138
Spacing138138138
セルA=B=C: 178.9722 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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マスク #1

ファイルemd_37860_msk_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: #2

ファイルemd_37860_half_map_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: #1

ファイルemd_37860_half_map_2.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : SpCas9-pegRNA-target DNA complex

全体名称: SpCas9-pegRNA-target DNA complex
要素
  • 複合体: SpCas9-pegRNA-target DNA complex
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
    • DNA: DNA (51-MER)
    • DNA: DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')
    • RNA: RNA (137-MER)
    • DNA: DNA (34-MER)

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超分子 #1: SpCas9-pegRNA-target DNA complex

超分子名称: SpCas9-pegRNA-target DNA complex / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: #1-#5
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)

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分子 #1: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

分子名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes serotype M1 (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 158.457578 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli 'BL21-Gold(DE3)pLysS AG' (大腸菌)
配列文字列: DKKYSIGLAI GTNSVGWAVI TDEYKVPSKK FKVLGNTDRH SIKKNLIGAL LFDSGETAEA TRLKRTARRR YTRRKNRICY LQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH M IKFRGHFL ...文字列:
DKKYSIGLAI GTNSVGWAVI TDEYKVPSKK FKVLGNTDRH SIKKNLIGAL LFDSGETAEA TRLKRTARRR YTRRKNRICY LQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH M IKFRGHFL IEGDLNPDNS DVDKLFIQLV QTYNQLFEEN PINASGVDAK AILSARLSKS RRLENLIAQL PGEKKNGLFG NL IALSLGL TPNFKSNFDL AEDAKLQLSK DTYDDDLDNL LAQIGDQYAD LFLAAKNLSD AILLSDILRV NTEITKAPLS ASM IKRYDE HHQDLTLLKA LVRQQLPEKY KEIFFDQSKN GYAGYIDGGA SQEEFYKFIK PILEKMDGTE ELLVKLNRED LLRK QRTFD NGSIPHQIHL GELHAILRRQ EDFYPFLKDN REKIEKILTF RIPYYVGPLA RGNSRFAWMT RKSEETITPW NFEEV VDKG ASAQSFIERM TNFDKNLPNE KVLPKHSLLY EYFTVYNELT KVKYVTEGMR KPAFLSGEQK KAIVDLLFKT NRKVTV KQL KEDYFKKIEC FDSVEISGVE DRFNASLGTY HDLLKIIKDK DFLDNEENED ILEDIVLTLT LFEDREMIEE RLKTYAH LF DDKVMKQLKR RRYTGWGRLS RKLINGIRDK QSGKTILDFL KSDGFANRNF MQLIHDDSLT FKEDIQKAQV SGQGDSLH E HIANLAGSPA IKKGILQTVK VVDELVKVMG RHKPENIVIE MARENQTTQK GQKNSRERMK RIEEGIKELG SQILKEHPV ENTQLQNEKL YLYYLQNGRD MYVDQELDIN RLSDYDVDAI VPQSFLKDDS IDNKVLTRSD KNRGKSDNVP SEEVVKKMKN YWRQLLNAK LITQRKFDNL TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS K LVSDFRKD FQFYKVREIN NYHHAHDAYL NAVVGTALIK KYPKLESEFV YGDYKVYDVR KMIAKSEQEI GKATAKYFFY SN IMNFFKT EITLANGEIR KRPLIETNGE TGEIVWDKGR DFATVRKVLS MPQVNIVKKT EVQTGGFSKE SILPKRNSDK LIA RKKDWD PKKYGGFDSP TVAYSVLVVA KVEKGKSKKL KSVKELLGIT IMERSSFEKN PIDFLEAKGY KEVKKDLIIK LPKY SLFEL ENGRKRMLAS AGELQKGNEL ALPSKYVNFL YLASHYEKLK GSPEDNEQKQ LFVEQHKHYL DEIIEQISEF SKRVI LADA NLDKVLSAYN KHRDKPIREQ AENIIHLFTL TNLGAPAAFK YFDTTIDRKR YTSTKEVLDA TLIHQSITGL YETRID LSQ LGGD

UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

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分子 #2: DNA (51-MER)

分子名称: DNA (51-MER) / タイプ: dna / ID: 2 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 15.636033 KDa
配列文字列: (DC)(DT)(DA)(DG)(DT)(DA)(DC)(DT)(DC)(DT) (DG)(DC)(DC)(DA)(DT)(DC)(DA)(DG)(DA)(DG) (DC)(DA)(DA)(DG)(DC)(DA)(DC)(DT)(DA) (DC)(DG)(DG)(DC)(DC)(DG)(DA)(DT)(DT)(DG) (DC) (DT)(DC)(DT)(DA)(DA) ...文字列:
(DC)(DT)(DA)(DG)(DT)(DA)(DC)(DT)(DC)(DT) (DG)(DC)(DC)(DA)(DT)(DC)(DA)(DG)(DA)(DG) (DC)(DA)(DA)(DG)(DC)(DA)(DC)(DT)(DA) (DC)(DG)(DG)(DC)(DC)(DG)(DA)(DT)(DT)(DG) (DC) (DT)(DC)(DT)(DA)(DA)(DG)(DT)(DG) (DA)(DT)(DC)

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分子 #3: DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')

分子名称: DNA (5'-D(*TP*GP*AP*TP*GP*GP*CP*AP*GP*AP*GP*TP*AP*CP*TP*AP*G)-3')
タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 5.291446 KDa
配列文字列:
(DT)(DG)(DA)(DT)(DG)(DG)(DC)(DA)(DG)(DA) (DG)(DT)(DA)(DC)(DT)(DA)(DG)

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分子 #5: DNA (34-MER)

分子名称: DNA (34-MER) / タイプ: dna / ID: 5 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 10.462743 KDa
配列文字列:
(DG)(DA)(DT)(DC)(DA)(DC)(DT)(DT)(DA)(DG) (DA)(DG)(DC)(DA)(DA)(DT)(DC)(DG)(DG)(DC) (DC)(DC)(DA)(DG)(DA)(DC)(DT)(DG)(DA) (DG)(DC)(DA)(DC)(DG)

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分子 #4: RNA (137-MER)

分子名称: RNA (137-MER) / タイプ: rna / ID: 4 / コピー数: 1
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 44.300379 KDa
配列文字列:
GGCCGUAGUG CUUGCUCUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAG UCGGUGCAGG AGGAAGCAGU GCAACCAAAC CACAGCGUGC UCAGUCUG

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

緩衝液pH: 8
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 297 K

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) / 平均電子線量: 50.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 1.6 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 0.8 µm
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

初期モデルモデルのタイプ: NONE
最終 再構成解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 3.2 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 197777
初期 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
FSC曲線 (解像度の算出)

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbjlvh1.pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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