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- EMDB-34919: CryoEM structure of HpaCas9-sgRNA-dsDNA in the presence of AcrIIC4 -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-34919
タイトルCryoEM structure of HpaCas9-sgRNA-dsDNA in the presence of AcrIIC4
マップデータ
試料
  • 複合体: Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4
    • 複合体: HpaCas9/AcrIIC4
      • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9
      • タンパク質・ペプチド: anti-CRISPR protein AcrIIC4
    • 複合体: RNA/DNA
      • RNA: sgRNA
      • DNA: target strand
      • DNA: non-target strand
キーワードCas9 / cleavage inhibition / ANTIMICROBIAL PROTEIN / HYDROLASE-RNA-ANTIMICROBIAL PROTEIN complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
RuvC endonuclease subdomain 3 / RuvC endonuclease subdomain 3 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9
類似検索 - 構成要素
生物種Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌) / synthetic construct (人工物)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.1 Å
データ登録者Sun W / Cheng Z / Wang J / Yang X / Wang Y
資金援助 中国, 1件
OrganizationGrant number国
National Natural Science Foundation of China (NSFC) 中国
引用ジャーナル: mBio / 年: 2018
タイトル: Potent Cas9 Inhibition in Bacterial and Human Cells by AcrIIC4 and AcrIIC5 Anti-CRISPR Proteins.
著者: Jooyoung Lee / Aamir Mir / Alireza Edraki / Bianca Garcia / Nadia Amrani / Hannah E Lou / Ildar Gainetdinov / April Pawluk / Raed Ibraheim / Xin D Gao / Pengpeng Liu / Alan R Davidson / Karen ...著者: Jooyoung Lee / Aamir Mir / Alireza Edraki / Bianca Garcia / Nadia Amrani / Hannah E Lou / Ildar Gainetdinov / April Pawluk / Raed Ibraheim / Xin D Gao / Pengpeng Liu / Alan R Davidson / Karen L Maxwell / Erik J Sontheimer /
要旨: In their natural settings, CRISPR-Cas systems play crucial roles in bacterial and archaeal adaptive immunity to protect against phages and other mobile genetic elements, and they are also widely used ...In their natural settings, CRISPR-Cas systems play crucial roles in bacterial and archaeal adaptive immunity to protect against phages and other mobile genetic elements, and they are also widely used as genome engineering technologies. Previously we discovered bacteriophage-encoded Cas9-specific anti-CRISPR (Acr) proteins that serve as countermeasures against host bacterial immunity by inactivating their CRISPR-Cas systems (A. Pawluk, N. Amrani, Y. Zhang, B. Garcia, et al., Cell 167:1829-1838.e9, 2016, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.017). We hypothesized that the evolutionary advantages conferred by anti-CRISPRs would drive the widespread occurrence of these proteins in nature (K. L. Maxwell, Mol Cell 68:8-14, 2017, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.09.002; A. Pawluk, A. R. Davidson, and K. L. Maxwell, Nat Rev Microbiol 16:12-17, 2018, https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.120; E. J. Sontheimer and A. R. Davidson, Curr Opin Microbiol 37:120-127, 2017, https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.06.003). We have identified new anti-CRISPRs using the same bioinformatic approach that successfully identified previous Acr proteins (A. Pawluk, N. Amrani, Y. Zhang, B. Garcia, et al., Cell 167:1829-1838.e9, 2016, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.017) against Cas9 (NmeCas9). In this work, we report two novel anti-CRISPR families in strains of and , both of which harbor type II-C CRISPR-Cas systems (A. Mir, A. Edraki, J. Lee, and E. J. Sontheimer, ACS Chem Biol 13:357-365, 2018, https://doi.org/10.1021/acschembio.7b00855). We characterize the type II-C Cas9 orthologs from and , show that the newly identified Acrs are able to inhibit these systems, and define important features of their inhibitory mechanisms. The Acr is the most potent NmeCas9 inhibitor identified to date. Although inhibition of NmeCas9 by anti-CRISPRs from and reveals cross-species inhibitory activity, more distantly related type II-C Cas9s are not inhibited by these proteins. The specificities of anti-CRISPRs and divergent Cas9s appear to reflect coevolution of their strategies to combat or evade each other. Finally, we validate these new anti-CRISPR proteins as potent off-switches for Cas9 genome engineering applications. As one of their countermeasures against CRISPR-Cas immunity, bacteriophages have evolved natural inhibitors known as anti-CRISPR (Acr) proteins. Despite the existence of such examples for type II CRISPR-Cas systems, we currently know relatively little about the breadth of Cas9 inhibitors, and most of their direct Cas9 targets are uncharacterized. In this work we identify two new type II-C anti-CRISPRs and their cognate Cas9 orthologs, validate their functionality and in bacteria, define their inhibitory spectrum against a panel of Cas9 orthologs, demonstrate that they act before Cas9 DNA binding, and document their utility as off-switches for Cas9-based tools in mammalian applications. The discovery of diverse anti-CRISPRs, the mechanistic analysis of their cognate Cas9s, and the definition of Acr inhibitory mechanisms afford deeper insight into the interplay between Cas9 orthologs and their inhibitors and provide greater scope for exploiting Acrs for CRISPR-based genome engineering.
履歴
登録2022年12月8日-
ヘッダ(付随情報) 公開2023年7月19日-
マップ公開2023年7月19日-
更新2024年7月3日-
現状2024年7月3日処理サイト: PDBj / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_34919.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_34919.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 23.8 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
ボクセルのサイズX=Y=Z: 1.04 Å
密度
表面レベル登録者による: 0.04
最小 - 最大-0.17136587 - 0.24574105
平均 (標準偏差)0.00037615726 (±0.009194293)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ184184184
Spacing184184184
セルA=B=C: 191.35999 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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ハーフマップ: #2

ファイルemd_34919_half_map_1.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: #1

ファイルemd_34919_half_map_2.map
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4

全体名称: Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4
要素
  • 複合体: Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4
    • 複合体: HpaCas9/AcrIIC4
      • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9
      • タンパク質・ペプチド: anti-CRISPR protein AcrIIC4
    • 複合体: RNA/DNA
      • RNA: sgRNA
      • DNA: target strand
      • DNA: non-target strand

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超分子 #1: Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4

超分子名称: Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4
タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: #1-#5
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
分子量理論値: 194 KDa

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超分子 #2: HpaCas9/AcrIIC4

超分子名称: HpaCas9/AcrIIC4 / タイプ: complex / ID: 2 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #1, #5

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超分子 #3: RNA/DNA

超分子名称: RNA/DNA / タイプ: complex / ID: 3 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #2-#4

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分子 #1: CRISPR-associated endonuclease Cas9

分子名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1
詳細: Two mutations D13A and H581A were introduced to inactivate the catalytic sites of HpaCas9. The first residue 'Ser' of the sample sequence is the one expressed from the vector left after tag cleavage.
コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
分子量理論値: 121.605695 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
配列文字列: SMENKNLNYI LGLALGIASV GWAVVEIDEK ENPLRLIDVG VRTFERAEVP KTGESLALSR RLARSARRLT QRRVARLKKA KRLLKSENI LLSTDERLPH QVWQLRVEGL DHKLERQEWA AVLLHLIKHR GYLSQRKNES KSENKELGAL LSGVDNNHKL L QQATYRSP ...文字列:
SMENKNLNYI LGLALGIASV GWAVVEIDEK ENPLRLIDVG VRTFERAEVP KTGESLALSR RLARSARRLT QRRVARLKKA KRLLKSENI LLSTDERLPH QVWQLRVEGL DHKLERQEWA AVLLHLIKHR GYLSQRKNES KSENKELGAL LSGVDNNHKL L QQATYRSP AELAVKKFEV EEGHIRNQQG AYTHTFSRLD LLAEMELLFS RQQHFGNPFA SEKLLENLTA LLMWQKPALS GE AILKMLG KCTFEDEYKA AKNTYSAERF VWITKLNNLR IQENGLERAL NDNERLALME QPYDKNRLFY SQVRSILKLS DEA IFKGLR YSGEDKKAIE TKAVLMEMKA YHQIRKVLEG NNLKAEWAEL KANPTLLDEI GTAFSLYKTD EDISAYLAGK LSQP VLNAL LENLSFDKFI QLSLKALYKL LPLMQQGLRY DEACREIYGD HYGKKTEENH HFLPQIPADE IRNPVVLRTL TQARK VING VVRLYGSPAR IHIETGREVG KSYKDRRELE KRQEENRKQR ENAIKEFKEY FPHFAGEPKA KDILKMRLYK QQNAKC LYS GKPIELHRLL EKGYVEVDAA LPFSRTWDDS FNNKVLVLAN ENQNKGNLTP FEWLDGKHNS ERWRAFKALV ETSAFPY AK KQRILSQKLD EKGFIERNLN DTRYVARFLC NFIADNMHLT GEGKRKVFAS NGQITALLRS RWGLAKSRED NDRHHALD A VVVACSTVAM QQKITRFVRF EAGDVFTGER IDRETGEIIP LHFPTPWQFF KQEVEIRIFS DNPKLELENR LPDRPQANH EFVQPLFVSR MPTRKMTGQG HMETVKSAKR LNEGISVIKM PLTKLKLKDL ELMVNREREK DLYDTLKARL EAFNDDPAKA FAEPFIKKG GAIVKSVRVE QIQKSGVLVR EGNGVADNAS MVRVDVFTKG GKYFLVPIYT WQVAKGILPN KAATQYKDEE D WEVMDNSA TFKFSLHPND LVKLVTKKKT ILGYFNGLNR ATGNIDIKEH DLDKSKGKQG IFEGVGIKLA LSFEKYQVDE LG KNIRLCK PSKRQPVR

UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9

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分子 #5: anti-CRISPR protein AcrIIC4

分子名称: anti-CRISPR protein AcrIIC4 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 5
詳細: WP_049372635.1;The first residue 'Ser' of the sample sequence is the one expressed from the vector left after tag cleavage.
コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
分子量理論値: 10.072395 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
配列文字列:
SMKITSSNFA TIATSENFAK LSVLPKNHRE PIKGLFKSAV EQFSSARDFF KNENYSKELA EKFNKEAVNE AVEKLQKAID LAEKQGIQF

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分子 #2: sgRNA

分子名称: sgRNA / タイプ: rna / ID: 2
詳細: RNA is originally derived from Haemophilus parainfluenzae and modified by author.
コピー数: 1
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 40.860125 KDa
配列文字列:
GGUCACUCUA ACAUUUAAUC ACACGUUGUA GCUCCCUUUU UCGAAAGAAA AACGUUGUUA CAAUAAGAGA AAAGAUUUCU CGCAAAGCU CUGUCCCUUG AAAUGUAAGU UUCAAGGGAC AUCUUUUUC

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分子 #3: target strand

分子名称: target strand / タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
分子量理論値: 10.865029 KDa
配列文字列:
(DT)(DG)(DA)(DA)(DA)(DT)(DC)(DA)(DT)(DA) (DT)(DG)(DT)(DG)(DT)(DG)(DA)(DT)(DT)(DA) (DA)(DA)(DT)(DG)(DT)(DT)(DA)(DG)(DA) (DG)(DT)(DG)(DA)(DC)(DC)

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分子 #4: non-target strand

分子名称: non-target strand / タイプ: dna / ID: 4 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
分子量理論値: 10.766954 KDa
配列文字列:
(DG)(DG)(DT)(DC)(DA)(DC)(DT)(DC)(DT)(DA) (DA)(DC)(DA)(DT)(DT)(DT)(DA)(DA)(DT)(DG) (DT)(DG)(DT)(DG)(DA)(DT)(DA)(DT)(DG) (DA)(DT)(DT)(DT)(DC)(DA)

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

緩衝液pH: 7.5
構成要素:
濃度式名称
100.0 mMNaClsodium chloride
20.0 mMTristris(hydroxymethyl)aminomethane
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 277 K

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 QUANTUM (4k x 4k)
平均電子線量: 60.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 1.6 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1.0 µm
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

初期モデルモデルのタイプ: PDB ENTRY
PDBモデル - PDB ID:

6jdq

最終 再構成解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 3.1 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 212049
初期 角度割当タイプ: PROJECTION MATCHING
最終 角度割当タイプ: ANGULAR RECONSTITUTION

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原子モデル構築 1

精密化プロトコル: RIGID BODY FIT
得られたモデル

PDB-8hnv:
CryoEM structure of HpaCas9-sgRNA-dsDNA in the presence of AcrIIC4

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbjlc1.pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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