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- EMDB-32104: Cryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-32104
タイトルCryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex
マップデータ
試料
  • 複合体: SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex
    • 複合体: SaCas9
      • タンパク質・ペプチド: SaCas9
    • 複合体: sgRNA-target DNA
      • RNA: single-guide RNA (sgRNA)
      • DNA: Target DNA strand(TS)
      • DNA: Non-target DNA strand (NTS)
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
: / CRISPR-associated endonuclease Cas9, C-terminal domain / Cas9, PI domain / Cas9, WED domain / CRISPR-Cas9 WED domain / CRISPR-Cas9 PI domain / : / Cas9 RuvC domain / HNH endonuclease / CRISPR-associated endonuclease Cas9 ...: / CRISPR-associated endonuclease Cas9, C-terminal domain / Cas9, PI domain / Cas9, WED domain / CRISPR-Cas9 WED domain / CRISPR-Cas9 PI domain / : / Cas9 RuvC domain / HNH endonuclease / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9
類似検索 - 構成要素
生物種Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌) / synthetic construct (人工物)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 4.3 Å
データ登録者Du WH / Huang Q / Zhu HX / Xue DM / Zheng S
資金援助 中国, 2件
OrganizationGrant number国
National Natural Science Foundation of China (NSFC)31971377 中国
National Natural Science Foundation of China (NSFC)31671386 中国
引用ジャーナル: Int J Mol Sci / 年: 2023
タイトル: Full-Length Model of SaCas9-sgRNA-DNA Complex in Cleavage State.
著者: Wenhao Du / Haixia Zhu / Jiaqiang Qian / Dongmei Xue / Sen Zheng / Qiang Huang /
要旨: Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined ... Cas9 (SaCas9) is a widely used genome editing tool. Understanding its molecular mechanisms of DNA cleavage could effectively guide the engineering optimization of this system. Here, we determined the first cryo-electron microscopy structure of the SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex. This structure reveals that the HNH nuclease domain is tightly bound to the cleavage site of the target DNA strand, and is in close contact with the WED and REC domains. Moreover, it captures the complete structure of the sgRNA, including the previously unresolved stem-loop 2. Based on this structure, we build a full-length model for the ternary complex in cleavage state. This model enables identification of the residues for the interactions between the HNH domain and the WED and REC domains. Moreover, we found that the stem-loop 2 of the sgRNA tightly binds to the PI and RuvC domains and may also regulate the position shift of the RuvC domain. Further mutagenesis and molecular dynamics simulations supported the idea that the interactions of the HNH domain with the WED and REC domains play an important role in the DNA cleavage. Thus, this study provides new mechanistic insights into the DNA cleavage of SaCas9 and is also useful for guiding the future engineering of SaCas9-mediated gene editing systems.
履歴
登録2021年10月25日-
ヘッダ(付随情報) 公開2023年3月15日-
マップ公開2023年3月15日-
更新2023年3月15日-
現状2023年3月15日処理サイト: PDBj / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_32104.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_32104.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 48.9 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
0.85 Å/pix.
x 234 pix.
= 198.9 Å		0.85 Å/pix.
x 234 pix.
= 198.9 Å		0.85 Å/pix.
x 234 pix.
= 198.9 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.85 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.0042
最小 - 最大-0.025862101 - 0.049840245
平均 (標準偏差)0.00023336892 (±0.0016744635)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ234234234
Spacing234234234
セルA=B=C: 198.90001 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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試料の構成要素

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全体 : SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex

全体名称: SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex
要素
  • 複合体: SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex
    • 複合体: SaCas9
      • タンパク質・ペプチド: SaCas9
    • 複合体: sgRNA-target DNA
      • RNA: single-guide RNA (sgRNA)
      • DNA: Target DNA strand(TS)
      • DNA: Non-target DNA strand (NTS)

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超分子 #1: SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex

超分子名称: SaCas9-sgRNA-target DNA ternary complex / タイプ: complex / ID: 1 / キメラ: Yes / 親要素: 0 / 含まれる分子: all
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)

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超分子 #2: SaCas9

超分子名称: SaCas9 / タイプ: complex / ID: 2 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #1

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超分子 #3: sgRNA-target DNA

超分子名称: sgRNA-target DNA / タイプ: complex / ID: 3 / 親要素: 1 / 含まれる分子: #2-#4

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分子 #1: SaCas9

分子名称: SaCas9 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / 光学異性体: LEVO
由来(天然)生物種: Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)
組換発現生物種: Escherichia coli (大腸菌)
配列文字列: MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MKRNYILGLA IGITSVGYGI IDYETRDVID AGVRLFKEAN VENNEGRRSK RGARRLKRRR RHRIQRVKKL LFDYNLLTDH SELSGINPYE ARVKGLSQKL SEEEFSAALL HLAKRRGVHN VNEVEEDTGN ELSTKEQISR NSKALEEKYV ...文字列:
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MKRNYILGLA IGITSVGYGI IDYETRDVID AGVRLFKEAN VENNEGRRSK RGARRLKRRR RHRIQRVKKL LFDYNLLTDH SELSGINPYE ARVKGLSQKL SEEEFSAALL HLAKRRGVHN VNEVEEDTGN ELSTKEQISR NSKALEEKYV AELQLERLKK DGEVRGSINR FKTSDYVKEA KQLLKVQKAY HQLDQSFIDT YIDLLETRRT YYEGPGEGSP FGWKDIKEWY EMLMGHCTYF PEELRSVKYA YNADLYNALN DLNNLVITRD ENEKLEYYEK FQIIENVFKQ KKKPTLKQIA KEILVNEEDI KGYRVTSTGK PEFTNLKVYH DIKDITARKE IIENAELLDQ IAKILTIYQS SEDIQEELTN LNSELTQEEI EQISNLKGYT GTHNLSLKAI NLILDELWHT NDNQIAIFNR LKLVPKKVDL SQQKEIPTTL VDDFILSPVV KRSFIQSIKV INAIIKKYGL PNDIIIELAR EKNSKDAQKM INEMQKRNRQ TNERIEEIIR TTGKENAKYL IEKIKLHDMQ EGKCLYSLEA IPLEDLLNNP FNYEVDHIIP RSVSFDNSFN NKVLVKQEEA SKKGNRTPFQ YLSSSDSKIS YETFKKHILN LAKGKGRISK TKKEYLLEER DINRFSVQKD FINRNLVDTR YATRGLMNLL RSYFRVNNLD VKVKSINGGF TSFLRRKWKF KKERNKGYKH HAEDALIIAN ADFIFKEWKK LDKAKKVMEN QMFEEKQAES MPEIETEQEY KEIFITPHQI KHIKDFKDYK YSHRVDKKPN RELINDTLYS TRKDDKGNTL IVNNLNGLYD KDNDKLKKLI NKSPEKLLMY HHDPQTYQKL KLIMEQYGDE KNPLYKYYEE TGNYLTKYSK KDNGPVIKKI KYYGNKLNAH LDITDDYPNS RNKVVKLSLK PYRFDVYLDN GVYKFVTVKN LDVIKKENYY EVNSKCYEEA KKLKKISNQA EFIASFYNND LIKINGELYR VIGVNNDLLN RIEVNMIDIT YREYLENMND KRPPRIIKTI ASKTQSIKKY STDILGNLYE VKSKKHPQII KKG

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分子 #2: single-guide RNA (sgRNA)

分子名称: single-guide RNA (sgRNA) / タイプ: rna / ID: 2
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
配列文字列:
GGUACCGCUC CAGUCGUUCA UGGUUUUAGU ACUCUGGAAA CAGAAUCUAC UAAAACAAGG CAAAAUGCCG UGUUUAUCUC GUCAACUUGU UGGCGAGAUU UUUUU

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分子 #3: Target DNA strand(TS)

分子名称: Target DNA strand(TS) / タイプ: dna / ID: 3 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
配列文字列:
TCCAGAGTAC TAAAACATTC AACATGAACG ACTGGAGCGG TACTATAGTG AGTCGTATT

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分子 #4: Non-target DNA strand (NTS)

分子名称: Non-target DNA strand (NTS) / タイプ: dna / ID: 4 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
配列文字列:
AATACGACTC ACTATAGTAC CGCTCCAGTC GTTCATGTTG AATGTTTTAG TACTCTGGA

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

濃度0.22 mg/mL
緩衝液pH: 7.5
構成要素:
濃度式名称
20.0 mMTristrihydroxymethyl aminomethane
100.0 mMKClpotassium chloride
5.0 mMMgCl2magnesium chloride
1.0 mMDTTdithiothreitol

詳細: 20mM Tris-Cl (pH 7.5), 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT
グリッドモデル: Quantifoil R1.2/1.3 / 材質: COPPER / メッシュ: 200 / 支持フィルム - 材質: CARBON / 支持フィルム - トポロジー: HOLEY / 前処理 - タイプ: GLOW DISCHARGE / 前処理 - 時間: 40 sec.
凍結凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 289 K / 装置: FEI VITROBOT MARK IV
詳細blot for 4 seconds before pluging

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電子顕微鏡法

顕微鏡FEI TITAN KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOQUANTUM (6k x 4k)
デジタル化 - サイズ - 横: 5760 pixel / デジタル化 - サイズ - 縦: 4092 pixel / 実像数: 10389 / 平均電子線量: 38.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2.6 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1.8 µm / 倍率（公称値）: 105000
試料ステージホルダー冷却材: NITROGEN
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

粒子像選択選択した数: 3872337
詳細: We used the program PARSED developed in our previous study to pick the complex particles from the micrographs(Yao R, et al. Bioinformatics. 2020, 36:1252-1259).
初期モデルモデルのタイプ: PDB ENTRY
PDBモデル - PDB ID:

5czz

最終 再構成想定した対称性 - 点群: C1 (非対称) / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 4.3 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 3.0.8) / 使用した粒子像数: 217173
初期 角度割当タイプ: RANDOM ASSIGNMENT / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 3.0.8)
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD / ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 3.0.8)
最終 3次元分類ソフトウェア - 名称: RELION (ver. 3.0.8)
FSC曲線 (解像度の算出)

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原子モデル構築 1

初期モデル(PDB ID:

5czz

,

5y36

)
精密化空間: REAL / プロトコル: FLEXIBLE FIT / 当てはまり具合の基準: correlation coefficient
得られたモデル

PDB-7vw3:
Cryo-EM structure of SaCas9-sgRNA-DNA ternary complex

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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