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万見
- PDB-9gs9: Tn7016 PseCAST QCascade -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 9gs9
タイトルTn7016 PseCAST QCascade
要素
  • Cas6
  • Cas7.1
  • Cas8
  • NT-DNA
  • T-DNA
  • TniQ.1
  • crRNA
キーワードRNA / CRISPR / transposon / genome
機能・相同性DNA / DNA (> 10) / RNA / RNA (> 10)
機能・相同性情報
生物種Pseudoalteromonas (バクテリア)
Pseudoalteromonas agarivorans S816 (バクテリア)
RNA satellites (ウイルス)
DNA molecule (その他)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.6 Å
データ登録者Lampe, G.D. / Liang, A.R. / Zhang, D.J. / Fernandez, I.S. / Sternberg, S.H.
資金援助 米国, 1件
組織認可番号国
National Institutes of Health/National Cancer Institute (NIH/NCI) 米国
引用ジャーナル: bioRxiv / 年: 2024
タイトル: Structure-guided engineering of type I-F CASTs for targeted gene insertion in human cells.
著者: George D Lampe / Ashley R Liang / Dennis J Zhang / Israel S Fernández / Samuel H Sternberg /
要旨: Conventional genome editing tools rely on DNA double-strand breaks (DSBs) and host recombination proteins to achieve large insertions, resulting in a heterogeneous mixture of undesirable editing ...Conventional genome editing tools rely on DNA double-strand breaks (DSBs) and host recombination proteins to achieve large insertions, resulting in a heterogeneous mixture of undesirable editing outcomes. We recently leveraged a type I-F CRISPR-associated transposase (CAST) from the Tn transposon (CAST) for DSB-free, RNA-guided DNA integration in human cells, taking advantage of its programmability and large payload capacity. CAST is the only characterized CAST system that has achieved human genomic DNA insertions, but multiple lines of evidence suggest that DNA binding may be a critical bottleneck that limits high-efficiency activity. Here we report structural determinants of target DNA recognition by the CAST QCascade complex using single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM), which revealed novel subtype-specific interactions and RNA-DNA heteroduplex features. By combining our structural data with target DNA library screens and rationally engineered protein mutations, we uncovered CAST variants that exhibit increased integration efficiency and modified PAM stringency. Structure predictions of key interfaces in the transpososome holoenzyme also revealed opportunities for the design of hybrid CASTs, which we leveraged to build chimeric systems that combine high-activity DNA binding and DNA integration modules. Collectively, our work provides unique structural insights into type I-F CAST systems while showcasing multiple diverse strategies to investigate and engineer new RNA-guided transposase architectures for human genome editing applications.
履歴
登録2024年9月13日登録サイト: PDBE / 処理サイト: PDBE
改定 1.02024年10月16日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12024年11月20日Group: Data collection / カテゴリ: em_admin / Item: _em_admin.last_update

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
1: crRNA
2: T-DNA
3: NT-DNA
A: Cas8
B: Cas7.1
C: Cas7.1
D: Cas7.1
E: Cas7.1
F: Cas7.1
G: Cas7.1
H: Cas6
I: TniQ.1
J: TniQ.1


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)486,96713
ポリマ－486,96713
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
  • 根拠: 電子顕微鏡法, not applicable
タイプ名称対称操作数
identity operation1_555x,y,z1

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要素

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RNA鎖 , 1種, 1分子 1

#1: RNA鎖 crRNA


分子量: 19501.658 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) RNA satellites (ウイルス)

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DNA鎖 , 2種, 2分子 23

#2: DNA鎖 T-DNA


分子量: 22801.545 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) DNA molecule (その他)
#3: DNA鎖 NT-DNA


分子量: 3296.191 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) DNA molecule (その他)

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タンパク質 , 4種, 10分子 ABCDEFGHIJ

#4: タンパク質 Cas8


分子量: 79290.211 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Pseudoalteromonas (バクテリア) / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)
#5: タンパク質
Cas7.1


分子量: 39845.145 Da / 分子数: 6 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Pseudoalteromonas (バクテリア) / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)
#6: タンパク質 Cas6


分子量: 23341.666 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現 / 由来: (組換発現) Pseudoalteromonas (バクテリア) / 発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)
#7: タンパク質 TniQ.1


分子量: 49832.406 Da / 分子数: 2 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Pseudoalteromonas agarivorans S816 (バクテリア)
発現宿主: Escherichia coli (大腸菌)

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詳細

Has protein modificationY

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素名称: Tn7016 PseCAST QCascade / タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT
分子量実験値: NO
由来(天然)生物種: Pseudoalteromonas aestuariivivens (バクテリア)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli B (大腸菌)
緩衝液pH: 7.5
試料包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
急速凍結凍結剤: ETHANE

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: OTHER
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2000 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 500 nm / C2レンズ絞り径: 50 µm
撮影電子線照射量: 50 e/Å2 / フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k)

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解析

CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
3次元再構成解像度: 2.6 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 150000 / 対称性のタイプ: POINT
精密化解像度: 2.6→2.6 Å / Cor.coef. Fo:Fc: 0.91 / SU B: 9.718 / SU ML: 0.18 / ESU R: 0.347
立体化学のターゲット値: MAXIMUM LIKELIHOOD WITH PHASES
詳細: HYDROGENS HAVE BEEN ADDED IN THE RIDING POSITIONS
Rfactor反射数%反射
Rwork0.26136 --
obs0.26136 188454 100 %
溶媒の処理イオンプローブ半径: 0.8 Å / 減衰半径: 0.8 Å / VDWプローブ半径: 1.2 Å / 溶媒モデル: MASK
原子変位パラメータBiso mean: 94.995 Å2
Baniso -1Baniso -2Baniso -3
1-0.16 Å2-0.1 Å20.39 Å2
2--0.35 Å2-1.17 Å2
3----0.51 Å2
精密化ステップサイクル: 1 / 合計: 20705
拘束条件
Refine-IDタイプDev idealDev ideal target数
ELECTRON MICROSCOPYr_bond_refined_d0.0030.01321362
ELECTRON MICROSCOPYr_bond_other_d0.0010.01718703
ELECTRON MICROSCOPYr_angle_refined_deg1.2741.58829347
ELECTRON MICROSCOPYr_angle_other_deg1.0961.64943515
ELECTRON MICROSCOPYr_dihedral_angle_1_deg12.1455.762865
ELECTRON MICROSCOPYr_dihedral_angle_2_deg32.0523.34943
ELECTRON MICROSCOPYr_dihedral_angle_3_deg13.156153202
ELECTRON MICROSCOPYr_dihedral_angle_4_deg15.2781584
ELECTRON MICROSCOPYr_chiral_restr0.0580.2012874
ELECTRON MICROSCOPYr_gen_planes_refined0.0030.0222685
ELECTRON MICROSCOPYr_gen_planes_other0.0020.024515
ELECTRON MICROSCOPYr_nbd_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_nbd_other
ELECTRON MICROSCOPYr_nbtor_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_nbtor_other
ELECTRON MICROSCOPYr_xyhbond_nbd_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_xyhbond_nbd_other
ELECTRON MICROSCOPYr_metal_ion_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_metal_ion_other
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_vdw_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_vdw_other
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_hbond_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_hbond_other
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_metal_ion_refined
ELECTRON MICROSCOPYr_symmetry_metal_ion_other
ELECTRON MICROSCOPYr_mcbond_it1.81310.3479650
ELECTRON MICROSCOPYr_mcbond_other1.81310.3479649
ELECTRON MICROSCOPYr_mcangle_it3.39315.50512038
ELECTRON MICROSCOPYr_mcangle_other3.39315.50512039
ELECTRON MICROSCOPYr_scbond_it1.24110.20711712
ELECTRON MICROSCOPYr_scbond_other1.24110.20711713
ELECTRON MICROSCOPYr_scangle_it
ELECTRON MICROSCOPYr_scangle_other2.38415.33617310
ELECTRON MICROSCOPYr_long_range_B_refined7.9226411
ELECTRON MICROSCOPYr_long_range_B_other7.9226412
ELECTRON MICROSCOPYr_rigid_bond_restr
ELECTRON MICROSCOPYr_sphericity_free
ELECTRON MICROSCOPYr_sphericity_bonded
LS精密化 シェル解像度: 3→3.078 Å / Total num. of bins used: 20
Rfactor反射数%反射
Rfree0 0 -
Rwork0.335 14042 -
obs--100 %

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

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  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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