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基本情報
登録情報 | データベース: PDB / ID: 7z4k | ||||||
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タイトル | SpCas9 bound to 10-nucleotide complementary DNA substrate | ||||||
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![]() | HYDROLASE / CRISPR / Cas9 / R-loop / substrate binding / off-target | ||||||
機能・相同性 | ![]() maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||
生物種 | ![]() synthetic construct (人工物) | ||||||
手法 | 電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.81 Å | ||||||
![]() | Pacesa, M. / Jinek, M. | ||||||
資金援助 | ![]()
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![]() | ![]() タイトル: R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9. 著者: Martin Pacesa / Luuk Loeff / Irma Querques / Lena M Muckenfuss / Marta Sawicka / Martin Jinek / ![]() 要旨: Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise ...Cas9 is a CRISPR-associated endonuclease capable of RNA-guided, site-specific DNA cleavage. The programmable activity of Cas9 has been widely utilized for genome editing applications, yet its precise mechanisms of target DNA binding and off-target discrimination remain incompletely understood. Here we report a series of cryo-electron microscopy structures of Streptococcus pyogenes Cas9 capturing the directional process of target DNA hybridization. In the early phase of R-loop formation, the Cas9 REC2 and REC3 domains form a positively charged cleft that accommodates the distal end of the target DNA duplex. Guide-target hybridization past the seed region induces rearrangements of the REC2 and REC3 domains and relocation of the HNH nuclease domain to assume a catalytically incompetent checkpoint conformation. Completion of the guide-target heteroduplex triggers conformational activation of the HNH nuclease domain, enabled by distortion of the guide-target heteroduplex, and complementary REC2 and REC3 domain rearrangements. Together, these results establish a structural framework for target DNA-dependent activation of Cas9 that sheds light on its conformational checkpoint mechanism and may facilitate the development of novel Cas9 variants and guide RNA designs with enhanced specificity and activity. | ||||||
履歴 |
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構造の表示
構造ビューア | 分子: ![]() ![]() |
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ダウンロードとリンク
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ダウンロード
PDBx/mmCIF形式 | ![]() | 323.2 KB | 表示 | ![]() |
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PDB形式 | ![]() | 251 KB | 表示 | ![]() |
PDBx/mmJSON形式 | ![]() | ツリー表示 | ![]() | |
その他 | ![]() |
-検証レポート
文書・要旨 | ![]() | 1.4 MB | 表示 | ![]() |
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文書・詳細版 | ![]() | 1.4 MB | 表示 | |
XML形式データ | ![]() | 57.8 KB | 表示 | |
CIF形式データ | ![]() | 85.5 KB | 表示 | |
アーカイブディレクトリ | ![]() ![]() | HTTPS FTP |
-関連構造データ
関連構造データ | ![]() 14500MC ![]() 7z4cC ![]() 7z4dC ![]() 7z4eC ![]() 7z4gC ![]() 7z4hC ![]() 7z4iC ![]() 7z4jC ![]() 7z4lC M: このデータのモデリングに利用したマップデータ C: 同じ文献を引用 ( |
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類似構造データ | 類似検索 - 機能・相同性 ![]() |
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リンク
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集合体
登録構造単位 | ![]()
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1 |
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要素
#1: タンパク質 | 分子量: 158588.781 Da / 分子数: 1 / 変異: D10A, H840A / 由来タイプ: 組換発現 由来: (組換発現) ![]() 遺伝子: cas9, csn1, SPy_1046 / 発現宿主: ![]() ![]() 参照: UniProt: Q99ZW2, 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 |
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#2: RNA鎖 | 分子量: 33005.641 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
#3: DNA鎖 | 分子量: 9786.305 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
#4: DNA鎖 | 分子量: 9822.324 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成 / 由来: (合成) synthetic construct (人工物) |
-実験情報
-実験
実験 | 手法: 電子顕微鏡法 |
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EM実験 | 試料の集合状態: PARTICLE / 3次元再構成法: 単粒子再構成法 |
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試料調製
構成要素 | 名称: Ternary complex of SpCas9-sgRNA bound to a 10-nucleotide complementary DNA substrate タイプ: COMPLEX / Entity ID: all / 由来: RECOMBINANT |
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分子量 | 実験値: NO |
由来(天然) | 生物種: ![]() |
由来(組換発現) | 生物種: ![]() ![]() |
緩衝液 | pH: 7.5 |
試料 | 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES |
急速凍結 | 凍結剤: ETHANE-PROPANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 293.15 K |
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電子顕微鏡撮影
実験機器 | ![]() モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |
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顕微鏡 | モデル: FEI TITAN KRIOS |
電子銃 | 電子線源: ![]() |
電子レンズ | モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス(公称値): 2400 nm / 最小 デフォーカス(公称値): 1000 nm / Cs: 2.7 mm |
撮影 | 電子線照射量: 66.22 e/Å2 / フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) |
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解析
ソフトウェア | 名称: PHENIX / バージョン: 1.20.1_4487: / 分類: 精密化 |
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CTF補正 | タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION |
3次元再構成 | 解像度: 3.81 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 127523 / 対称性のタイプ: POINT |