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- EMDB-47941: SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State ... -

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基本情報

登録情報
データベース: EMDB / ID: EMD-47941
タイトルSpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State III - checkpoint)
マップデータSpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State III - checkpoint)
試料
  • 複合体: Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA
    • RNA: sgRNA
    • DNA: PAM-proximal Target Strand
    • DNA: PAM-distal Target Strand
    • DNA: Non-target strand
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
キーワードCRISPR-associated endonuclease / DNA BINDING PROTEIN / DNA BINDING PROTEIN-DNA-RNA complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / 3'-5' exonuclease activity / DNA endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / : / Cas9 RuvC domain / HNH endonuclease / CRISPR-associated endonuclease Cas9 ...CRISPR-associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain / CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix / CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe / REC lobe of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Bridge helix of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / PAM-interacting domain of CRISPR-associated endonuclease Cas9 / : / Cas9 RuvC domain / HNH endonuclease / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1
類似検索 - 構成要素
生物種Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌) / synthetic construct (人工物)
手法単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.95 Å
データ登録者Kiernan KA / Taylor DW
資金援助 米国, 3件
OrganizationGrant number国
National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS)R35GM138348 米国
Welch FoundationF-1938-20200401 米国
American Cancer SocietyRSG-21-050-01-DMC 米国
引用ジャーナル: Nat Commun / 年: 2025
タイトル: Visualization of a multi-turnover Cas9 after product release.
著者: Kaitlyn A Kiernan / David W Taylor /
要旨: While the most widely used CRISPR-Cas enzyme is the Cas9 endonuclease from Streptococcus pyogenes (Cas9), it exhibits single-turnover enzyme kinetics which leads to long residence times on product ...While the most widely used CRISPR-Cas enzyme is the Cas9 endonuclease from Streptococcus pyogenes (Cas9), it exhibits single-turnover enzyme kinetics which leads to long residence times on product DNA. This blocks access to DNA repair machinery and acts as a major bottleneck during CRISPR-Cas9 gene editing. Cas9 can eventually be removed from the product by extrinsic factors, such as translocating polymerases, but the mechanisms contributing to Cas9 dissociation following cleavage remain poorly understood. Here, we employ truncated guide RNAs as a strategy to weaken PAM-distal nucleic acid interactions and promote faster enzyme turnover. Using kinetics-guided cryo-EM, we examine the conformational landscape of a multi-turnover Cas9, including the first detailed snapshots of Cas9 dissociating from product DNA. We discovered that while the PAM-distal product dissociates from Cas9 following cleavage, tight binding of the PAM-proximal product directly inhibits re-binding of new targets. Our work provides direct evidence as to why Cas9 acts as a single-turnover enzyme and will guide future Cas9 engineering efforts.
履歴
登録2024年11月16日-
ヘッダ(付随情報) 公開2025年6月18日-
マップ公開2025年6月18日-
更新2025年7月9日-
現状2025年7月9日処理サイト: RCSB / 状態: 公開

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構造の表示

添付画像

emd_47941.png

ダウンロードとリンク

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マップ

ファイルダウンロード / ファイル: emd_47941.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 512 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES)
注釈SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State III - checkpoint)
投影像・断面図

画像のコントロール

大きさ
明度
コントラスト
その他
軸Z (Sec.)Y (Row.)X (Col.)
0.83 Å/pix.
x 512 pix.
= 426.598 Å		0.83 Å/pix.
x 512 pix.
= 426.598 Å		0.83 Å/pix.
x 512 pix.
= 426.598 Å

表面

投影像

断面 (1/3)

断面 (1/2)

断面 (2/3)

画像は Spider により作成

ボクセルのサイズX=Y=Z: 0.8332 Å
密度

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)
表面レベル登録者による: 0.1
最小 - 最大-0.40167794 - 0.79676324
平均 (標準偏差)-0.00008970133 (±0.011957531)
対称性空間群: 1
詳細

EMDB XML:

マップ形状
Axis orderXYZ
Origin000
サイズ512512512
Spacing512512512
セルA=B=C: 426.5984 Å
α=β=γ: 90.0 °

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添付データ

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ハーフマップ: Half Map B

ファイルemd_47941_half_map_1.map
注釈Half Map B
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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ハーフマップ: Half Map A

ファイルemd_47941_half_map_2.map
注釈Half Map A
投影像・断面図
軸ZYX

投影像

断面 (1/2)
密度ヒストグラム

ヒストグラム

ヒストグラム (対数)

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試料の構成要素

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全体 : Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA

全体名称: Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA
要素
  • 複合体: Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA
    • RNA: sgRNA
    • DNA: PAM-proximal Target Strand
    • DNA: PAM-distal Target Strand
    • DNA: Non-target strand
    • タンパク質・ペプチド: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

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超分子 #1: Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA

超分子名称: Ternary complex - SpCas9, mm2 sgRNA, 55-bp dsDNA / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: #1, #4, #2-#3, #5
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)

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分子 #1: sgRNA

分子名称: sgRNA / タイプ: rna / ID: 1 / コピー数: 1
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 31.335643 KDa
配列文字列:
CGAUAAAGAU GAGACGCGUU UUAGAGCUAG AAAUAGCAAG UUAAAAUAAG GCUAGUCCGU UAUCAACUUG AAAAAGUGGC ACCGAGUCG GUGCUUUU

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分子 #2: PAM-distal Target Strand

分子名称: PAM-distal Target Strand / タイプ: dna / ID: 2 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 10.077479 KDa
配列文字列:
(DT)(DC)(DT)(DC)(DA)(DT)(DC)(DT)(DT)(DT) (DA)(DT)(DG)(DC)(DG)(DT)(DC)(DA)(DG)(DC) (DA)(DG)(DA)(DG)(DA)(DT)(DT)(DT)(DC) (DT)(DG)(DC)(DT)

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分子 #3: Non-target strand

分子名称: Non-target strand / タイプ: dna / ID: 3 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 17.026959 KDa
配列文字列: (DA)(DG)(DC)(DA)(DG)(DA)(DA)(DA)(DT)(DC) (DT)(DC)(DT)(DG)(DC)(DT)(DG)(DA)(DC)(DG) (DC)(DA)(DT)(DA)(DA)(DA)(DG)(DA)(DT) (DG)(DA)(DG)(DA)(DC)(DG)(DC)(DT)(DG)(DG) (DA) (DG)(DT)(DA)(DC)(DA) ...文字列:
(DA)(DG)(DC)(DA)(DG)(DA)(DA)(DA)(DT)(DC) (DT)(DC)(DT)(DG)(DC)(DT)(DG)(DA)(DC)(DG) (DC)(DA)(DT)(DA)(DA)(DA)(DG)(DA)(DT) (DG)(DA)(DG)(DA)(DC)(DG)(DC)(DT)(DG)(DG) (DA) (DG)(DT)(DA)(DC)(DA)(DA)(DA)(DC) (DG)(DT)(DC)(DA)(DG)(DC)(DT)

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分子 #4: PAM-proximal Target Strand

分子名称: PAM-proximal Target Strand / タイプ: dna / ID: 4 / コピー数: 1 / 分類: DNA
由来(天然)生物種: synthetic construct (人工物)
分子量理論値: 6.743352 KDa
配列文字列:
(DA)(DG)(DC)(DT)(DG)(DA)(DC)(DG)(DT)(DT) (DT)(DG)(DT)(DA)(DC)(DT)(DC)(DC)(DA)(DG) (DC)(DG)

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分子 #5: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

分子名称: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 / タイプ: protein_or_peptide / ID: 5 / コピー数: 1 / 光学異性体: LEVO
EC番号: 加水分解酵素; エステル加水分解酵素
由来(天然)生物種: Streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
分子量理論値: 158.699844 KDa
組換発現生物種: Escherichia coli (大腸菌)
配列文字列: MDKKYSIGLD IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNE MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA DLRLIYLALA H MIKFRGHF ...文字列:
MDKKYSIGLD IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNE MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA DLRLIYLALA H MIKFRGHF LIEGDLNPDN SDVDKLFIQL VQTYNQLFEE NPINASGVDA KAILSARLSK SRRLENLIAQ LPGEKKNGLF GN LIALSLG LTPNFKSNFD LAEDAKLQLS KDTYDDDLDN LLAQIGDQYA DLFLAAKNLS DAILLSDILR VNTEITKAPL SAS MIKRYD EHHQDLTLLK ALVRQQLPEK YKEIFFDQSK NGYAGYIDGG ASQEEFYKFI KPILEKMDGT EELLVKLNRE DLLR KQRTF DNGSIPHQIH LGELHAILRR QEDFYPFLKD NREKIEKILT FRIPYYVGPL ARGNSRFAWM TRKSEETITP WNFEE VVDK GASAQSFIER MTNFDKNLPN EKVLPKHSLL YEYFTVYNEL TKVKYVTEGM RKPAFLSGEQ KKAIVDLLFK TNRKVT VKQ LKEDYFKKIE CFDSVEISGV EDRFNASLGT YHDLLKIIKD KDFLDNEENE DILEDIVLTL TLFEDREMIE ERLKTYA HL FDDKVMKQLK RRRYTGWGRL SRKLINGIRD KQSGKTILDF LKSDGFANRN FMQLIHDDSL TFKEDIQKAQ VSGQGDSL H EHIANLAGSP AIKKGILQTV KVVDELVKVM GRHKPENIVI EMARENQTTQ KGQKNSRERM KRIEEGIKEL GSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDH IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNA KLITQRKFDN LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK S KLVSDFRK DFQFYKVREI NNYHHAHDAY LNAVVGTALI KKYPKLESEF VYGDYKVYDV RKMIAKSEQE IGKATAKYFF YS NIMNFFK TEITLANGEI RKRPLIETNG ETGEIVWDKG RDFATVRKVL SMPQVNIVKK TEVQTGGFSK ESILPKRNSD KLI ARKKDW DPKKYGGFDS PTVAYSVLVV AKVEKGKSKK LKSVKELLGI TIMERSSFEK NPIDFLEAKG YKEVKKDLII KLPK YSLFE LENGRKRMLA SAGELQKGNE LALPSKYVNF LYLASHYEKL KGSPEDNEQK QLFVEQHKHY LDEIIEQISE FSKRV ILAD ANLDKVLSAY NKHRDKPIRE QAENIIHLFT LTNLGAPAAF KYFDTTIDRK RYTSTKEVLD ATLIHQSITG LYETRI DLS QLGGD

UniProtKB: CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1

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実験情報

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構造解析

手法クライオ電子顕微鏡法
解析単粒子再構成法
試料の集合状態particle

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試料調製

緩衝液pH: 7.5
凍結凍結剤: ETHANE

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電子顕微鏡法

顕微鏡TFS KRIOS
撮影フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 BIOCONTINUUM (6k x 4k)
平均電子線量: 80.0 e/Å2
電子線加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN
電子光学系照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 2.2 µm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1.2 µm
実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company

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画像解析

CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
初期モデルモデルのタイプ: NONE
最終 再構成解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 2.95 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 使用した粒子像数: 59974
初期 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
最終 角度割当タイプ: MAXIMUM LIKELIHOOD
FSC曲線 (解像度の算出)

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原子モデル構築 1

初期モデルPDB ID:

6o0z


Chain - Source name: PDB / Chain - Initial model type: experimental model
得られたモデル

PDB-9ed9:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State III - checkpoint)

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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