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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-27317 | ||||||||||||
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タイトル | CryoEM structure of anaerobically prepared nitrogenase MoFe-protein on ultrathin carbon | ||||||||||||
マップデータ | |||||||||||||
試料 |
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キーワード | Nitrogenase (ニトロゲナーゼ) / metalloenzyme (金属タンパク質) / METAL BINDING PROTEIN / OXIDOREDUCTASE (酸化還元酵素) | ||||||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 molybdenum-iron nitrogenase complex / ニトロゲナーゼ / carbonyl sulfide nitrogenase activity / nitrogenase activity / 窒素固定 / iron-sulfur cluster binding / ATP binding / metal ion binding 類似検索 - 分子機能 | ||||||||||||
生物種 | Azotobacter vinelandii (窒素固定) | ||||||||||||
手法 | 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 2.26 Å | ||||||||||||
データ登録者 | Warmack RA / Rees DC | ||||||||||||
資金援助 | 米国, 3件
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引用 | ジャーナル: Nat Protoc / 年: 2024 タイトル: Anaerobic cryoEM protocols for air-sensitive nitrogenase proteins. 著者: Rebeccah A Warmack / Belinda B Wenke / Thomas Spatzal / Douglas C Rees / 要旨: Single-particle cryo-electron microscopy (cryoEM) provides an attractive avenue for advancing our atomic resolution understanding of materials, molecules and living systems. However, the vast ...Single-particle cryo-electron microscopy (cryoEM) provides an attractive avenue for advancing our atomic resolution understanding of materials, molecules and living systems. However, the vast majority of published cryoEM methodologies focus on the characterization of aerobically purified samples. Air-sensitive enzymes and microorganisms represent important yet understudied systems in structural biology. We have recently demonstrated the success of an anaerobic single-particle cryoEM workflow applied to the air-sensitive nitrogenase enzymes. In this protocol, we detail the use of Schlenk lines and anaerobic chambers to prepare samples, including a protein tag for monitoring sample exposure to oxygen in air. We describe how to use a plunge freezing apparatus inside of a soft-sided vinyl chamber of the type we routinely use for anaerobic biochemistry and crystallography of oxygen-sensitive proteins. Manual control of the airlock allows for introduction of liquid cryogens into the tent. A custom vacuum port provides slow, continuous evacuation of the tent atmosphere to avoid accumulation of flammable vapors within the enclosed chamber. These methods allowed us to obtain high-resolution structures of both nitrogenase proteins using single-particle cryoEM. The procedures involved can be generally subdivided into a 4 d anaerobic sample generation procedure, and a 1 d anaerobic cryoEM sample preparation step, followed by conventional cryoEM imaging and processing steps. As nitrogen is a substrate for nitrogenase, the Schlenk lines and anaerobic chambers described in this procedure are operated under an argon atmosphere; however, the system and these procedures are compatible with other controlled gas environments. | ||||||||||||
履歴 |
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-構造の表示
添付画像 |
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-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_27317.map.gz | 382.9 MB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-27317-v30.xml emd-27317.xml | 16.9 KB 16.9 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
FSC (解像度算出) | emd_27317_fsc.xml | 19.1 KB | 表示 | FSCデータファイル |
画像 | emd_27317.png | 62.9 KB | ||
Filedesc metadata | emd-27317.cif.gz | 5.8 KB | ||
その他 | emd_27317_half_map_1.map.gz emd_27317_half_map_2.map.gz | 691.2 MB 691.2 MB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-27317 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-27317 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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「今月の分子」の関連する項目 |
-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_27317.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 744.3 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||
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ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 0.65 Å | ||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
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-添付データ
-ハーフマップ: #2
ファイル | emd_27317_half_map_1.map | ||||||||||||
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投影像・断面図 |
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密度ヒストグラム |
-ハーフマップ: #1
ファイル | emd_27317_half_map_2.map | ||||||||||||
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投影像・断面図 |
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密度ヒストグラム |
-試料の構成要素
-全体 : Heterotetrameric nitrogenase MoFe-protein
全体 | 名称: Heterotetrameric nitrogenase MoFe-protein |
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要素 |
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-超分子 #1: Heterotetrameric nitrogenase MoFe-protein
超分子 | 名称: Heterotetrameric nitrogenase MoFe-protein / タイプ: complex / ID: 1 / 親要素: 0 / 含まれる分子: #1-#2 |
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由来(天然) | 生物種: Azotobacter vinelandii (窒素固定) |
-分子 #1: Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain
分子 | 名称: Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 / コピー数: 2 / 光学異性体: LEVO / EC番号: ニトロゲナーゼ |
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由来(天然) | 生物種: Azotobacter vinelandii (窒素固定) |
分子量 | 理論値: 55.363043 KDa |
配列 | 文字列: MTGMSREEVE SLIQEVLEVY PEKARKDRNK HLAVNDPAVT QSKKCIISNK KSQPGLMTIR GCAYAGSKGV VWGPIKDMIH ISHGPVGCG QYSRAGRRNY YIGTTGVNAF VTMNFTSDFQ EKDIVFGGDK KLAKLIDEVE TLFPLNKGIS VQSECPIGLI G DDIESVSK ...文字列: MTGMSREEVE SLIQEVLEVY PEKARKDRNK HLAVNDPAVT QSKKCIISNK KSQPGLMTIR GCAYAGSKGV VWGPIKDMIH ISHGPVGCG QYSRAGRRNY YIGTTGVNAF VTMNFTSDFQ EKDIVFGGDK KLAKLIDEVE TLFPLNKGIS VQSECPIGLI G DDIESVSK VKGAELSKTI VPVRCEGFRG VSQSLGHHIA NDAVRDWVLG KRDEDTTFAS TPYDVAIIGD YNIGGDAWSS RI LLEEMGL RCVAQWSGDG SISEIELTPK VKLNLVHCYR SMNYISRHME EKYGIPWMEY NFFGPTKTIE SLRAIAAKFD ESI QKKCEE VIAKYKPEWE AVVAKYRPRL EGKRVMLYIG GLRPRHVIGA YEDLGMEVVG TGYEFAHNDD YDRTMKEMGD STLL YDDVT GYEFEEFVKR IKPDLIGSGI KEKFIFQKMG IPFREMHSWD YSGPYHGFDG FAIFARDMDM TLNNPCWKKL QAPWE ASEG AEKVAASA UniProtKB: Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain |
-分子 #2: Nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain
分子 | 名称: Nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain / タイプ: protein_or_peptide / ID: 2 / コピー数: 2 / 光学異性体: LEVO / EC番号: ニトロゲナーゼ |
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由来(天然) | 生物種: Azotobacter vinelandii (窒素固定) |
分子量 | 理論値: 59.535879 KDa |
配列 | 文字列: MSQQVDKIKA SYPLFLDQDY KDMLAKKRDG FEEKYPQDKI DEVFQWTTTK EYQELNFQRE ALTVNPAKAC QPLGAVLCAL GFEKTMPYV HGSQGCVAYF RSYFNRHFRE PVSCVSDSMT EDAAVFGGQQ NMKDGLQNCK ATYKPDMIAV STTCMAEVIG D DLNAFINN ...文字列: MSQQVDKIKA SYPLFLDQDY KDMLAKKRDG FEEKYPQDKI DEVFQWTTTK EYQELNFQRE ALTVNPAKAC QPLGAVLCAL GFEKTMPYV HGSQGCVAYF RSYFNRHFRE PVSCVSDSMT EDAAVFGGQQ NMKDGLQNCK ATYKPDMIAV STTCMAEVIG D DLNAFINN SKKEGFIPDE FPVPFAHTPS FVGSHVTGWD NMFEGIARYF TLKSMDDKVV GSNKKINIVP GFETYLGNFR VI KRMLSEM GVGYSLLSDP EEVLDTPADG QFRMYAGGTT QEEMKDAPNA LNTVLLQPWH LEKTKKFVEG TWKHEVPKLN IPM GLDWTD EFLMKVSEIS GQPIPASLTK ERGRLVDMMT DSHTWLHGKR FALWGDPDFV MGLVKFLLEL GCEPVHILCH NGNK RWKKA VDAILAASPY GKNATVYIGK DLWHLRSLVF TDKPDFMIGN SYGKFIQRDT LHKGKEFEVP LIRIGFPIFD RHHLH RSTT LGYEGAMQIL TTLVNSILER LDEETRGMQA TDYNHDLVR UniProtKB: Nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain |
-分子 #3: iron-sulfur-molybdenum cluster with interstitial carbon
分子 | 名称: iron-sulfur-molybdenum cluster with interstitial carbon タイプ: ligand / ID: 3 / コピー数: 2 / 式: ICS |
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分子量 | 理論値: 787.451 Da |
Chemical component information | ChemComp-ICE: |
-分子 #4: 3-HYDROXY-3-CARBOXY-ADIPIC ACID
分子 | 名称: 3-HYDROXY-3-CARBOXY-ADIPIC ACID / タイプ: ligand / ID: 4 / コピー数: 2 / 式: HCA |
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分子量 | 理論値: 206.15 Da |
Chemical component information | ChemComp-HCA: |
-分子 #5: FE (III) ION
分子 | 名称: FE (III) ION / タイプ: ligand / ID: 5 / コピー数: 2 / 式: FE |
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分子量 | 理論値: 55.845 Da |
-分子 #6: FE(8)-S(7) CLUSTER
分子 | 名称: FE(8)-S(7) CLUSTER / タイプ: ligand / ID: 6 / コピー数: 2 / 式: CLF |
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分子量 | 理論値: 671.215 Da |
Chemical component information | ChemComp-CLF: |
-分子 #7: water
分子 | 名称: water / タイプ: ligand / ID: 7 / コピー数: 770 / 式: HOH |
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分子量 | 理論値: 18.015 Da |
Chemical component information | ChemComp-HOH: |
-実験情報
-構造解析
手法 | クライオ電子顕微鏡法 |
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解析 | 単粒子再構成法 |
試料の集合状態 | particle |
-試料調製
濃度 | 1.0 mg/mL |
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緩衝液 | pH: 7.8 |
凍結 | 凍結剤: ETHANE-PROPANE |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | TFS KRIOS |
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電子線 | 加速電圧: 300 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | 照射モード: OTHER / 撮影モード: BRIGHT FIELDBright-field microscopy / 最大 デフォーカス(公称値): -3.0 µm / 最小 デフォーカス(公称値): -0.8 µm |
撮影 | フィルム・検出器のモデル: GATAN K3 (6k x 4k) / 平均電子線量: 60.0 e/Å2 |
実験機器 | モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company |