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タイトルStructural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor.
ジャーナル・号・ページNature, Vol. 631, Issue 8019, Page 224-231, Year 2024
掲載日2024年5月29日
著者Yutaro Shuto / Ryoya Nakagawa / Shiyou Zhu / Mizuki Hoki / Satoshi N Omura / Hisato Hirano / Yuzuru Itoh / Feng Zhang / Osamu Nureki /
PubMed 要旨The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing ...The prime editor system composed of Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9) and engineered Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) collaborates with a prime editing guide RNA (pegRNA) to facilitate a wide variety of precise genome edits in living cells. However, owing to a lack of structural information, the molecular mechanism of pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor remains poorly understood. Here we present cryo-electron microscopy structures of the SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA complex in multiple states. The termination structure, along with our functional analysis, reveals that M-MLV RT extends reverse transcription beyond the expected site, resulting in scaffold-derived incorporations that cause undesired edits at the target loci. Furthermore, structural comparisons among the pre-initiation, initiation and elongation states show that M-MLV RT remains in a consistent position relative to SpCas9 during reverse transcription, whereas the pegRNA-synthesized DNA heteroduplex builds up along the surface of SpCas9. On the basis of our structural insights, we rationally engineered pegRNA variants and prime-editor variants in which M-MLV RT is fused within SpCas9. Collectively, our findings provide structural insights into the stepwise mechanism of prime editing, and will pave the way for the development of a versatile prime editing toolbox.
リンクNature / PubMed:38811740 / PubMed Central
手法EM (単粒子)
解像度2.9 - 6.06 Å
構造データ

37858

8wus

EMDB-37858, PDB-8wus:
SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (termination)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 2.9 Å

37859

8wut

EMDB-37859, PDB-8wut:
SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (initiation)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.0 Å

37860

8wuu

EMDB-37860, PDB-8wuu:
SpCas9-pegRNA-target DNA complex (pre-initiation)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.2 Å

37861

8wuv

EMDB-37861, PDB-8wuv:
SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 16-nt)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.0 Å

39253

8ygj

EMDB-39253, PDB-8ygj:
SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 28-nt)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.2 Å

EMDB-39306: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (termination) overall map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.0 Å

EMDB-39307: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (termination) focused map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.48 Å

EMDB-39308: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (initiation) overall map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.2 Å

EMDB-39309: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (initiation) focused map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 4.1 Å

EMDB-39314: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 16-nt) overall map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.1 Å

EMDB-39315: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 16-nt) focused map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 6.06 Å

EMDB-39316: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 28-nt) overall map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.2 Å

EMDB-39317: SpCas9-MMLV RT-pegRNA-target DNA complex (elongation 28-nt) focused map
手法: EM (単粒子) / 解像度: 4.5 Å

由来
  • streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
  • moloney murine leukemia virus (ウイルス)
  • streptococcus pyogenes serotype m1 (化膿レンサ球菌)
キーワードRNA BINDING PROTEIN/RNA/DNA / CRISPR-Cas / RNA BINDING PROTEIN-RNA-DNA complex / RNA BINDING PROTEIN / RNA BINDING PROTEIN/DNA/RNA / RNA BINDING PROTEIN-DNA-RNA COMPLEX

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万見文献について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 万見 (Yorodumi) / EMN文献 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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