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タイトルVisualization of a multi-turnover Cas9 after product release.
ジャーナル・号・ページNat Commun, Vol. 16, Issue 1, Page 5681, Year 2025
掲載日2025年7月1日
著者Kaitlyn A Kiernan / David W Taylor /
PubMed 要旨While the most widely used CRISPR-Cas enzyme is the Cas9 endonuclease from Streptococcus pyogenes (Cas9), it exhibits single-turnover enzyme kinetics which leads to long residence times on product ...While the most widely used CRISPR-Cas enzyme is the Cas9 endonuclease from Streptococcus pyogenes (Cas9), it exhibits single-turnover enzyme kinetics which leads to long residence times on product DNA. This blocks access to DNA repair machinery and acts as a major bottleneck during CRISPR-Cas9 gene editing. Cas9 can eventually be removed from the product by extrinsic factors, such as translocating polymerases, but the mechanisms contributing to Cas9 dissociation following cleavage remain poorly understood. Here, we employ truncated guide RNAs as a strategy to weaken PAM-distal nucleic acid interactions and promote faster enzyme turnover. Using kinetics-guided cryo-EM, we examine the conformational landscape of a multi-turnover Cas9, including the first detailed snapshots of Cas9 dissociating from product DNA. We discovered that while the PAM-distal product dissociates from Cas9 following cleavage, tight binding of the PAM-proximal product directly inhibits re-binding of new targets. Our work provides direct evidence as to why Cas9 acts as a single-turnover enzyme and will guide future Cas9 engineering efforts.
リンクNat Commun / PubMed:40593576 / PubMed Central
手法EM (単粒子)
解像度2.76 - 3.1 Å
構造データ

47834

9eak

EMDB-47834, PDB-9eak:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State I - pre-activation)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 2.76 Å

47835

9eal

EMDB-47835, PDB-9eal:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State II - precleavage)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 2.83 Å

47941

9ed9

EMDB-47941, PDB-9ed9:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State III - checkpoint)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 2.95 Å

47942

9eda

EMDB-47942, PDB-9eda:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State IV - product)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 2.88 Å

47943

9edb

EMDB-47943, PDB-9edb:
SpCas9 with 17-bp R-loop containing 2 terminal mismatches (State V - dissociated)
手法: EM (単粒子) / 解像度: 3.1 Å

化合物

ChemComp-MG:
Unknown entry / マグネシウムジカチオン

ChemComp-HOH:
WATER

由来
  • streptococcus pyogenes (化膿レンサ球菌)
  • synthetic construct (人工物)
キーワードHydrolase/DNA/RNA / CRISPR-associated endonuclease / DNA BINDING PROTEIN / Hydrolase-DNA-RNA complex / Type II-A / RNA-guided / DNA targeting / Mg2+ dependent / DNA BINDING PROTEIN/DNA/RNA / DNA BINDING PROTEIN-DNA-RNA complex

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万見文献について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 万見 (Yorodumi) / EMN文献 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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