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- PDB-6mwq: Single particle cryoEM structure of a DARPin-aldolase platform in... -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 6mwq
タイトルSingle particle cryoEM structure of a DARPin-aldolase platform in complex with GFP
要素
  • DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
  • Green fluorescent protein緑色蛍光タンパク質
キーワードLYASE/FLUORESCENT PROTEIN / synthetic construct / platform / single particle cryoEM / small protein display / LYASE-FLUORESCENT PROTEIN complex
機能・相同性
機能・相同性情報


negative regulation of Arp2/3 complex-mediated actin nucleation / fructose-bisphosphate aldolase / fructose-bisphosphate aldolase activity / M band / I band / 生物発光 / generation of precursor metabolites and energy / glycolytic process / protein homotetramerization / positive regulation of cell migration
類似検索 - 分子機能
Fructose-bisphosphate aldolase class-I active site / Fructose-bisphosphate aldolase class-I active site. / Fructose-bisphosphate aldolase, class-I / Fructose-bisphosphate aldolase class-I / 緑色蛍光タンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 / Green fluorescent protein, GFP / Green fluorescent protein-related / 緑色蛍光タンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 ...Fructose-bisphosphate aldolase class-I active site / Fructose-bisphosphate aldolase class-I active site. / Fructose-bisphosphate aldolase, class-I / Fructose-bisphosphate aldolase class-I / 緑色蛍光タンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 / Green fluorescent protein, GFP / Green fluorescent protein-related / 緑色蛍光タンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 / Aldolase-type TIM barrel / Βバレル / Mainly Beta
類似検索 - ドメイン・相同性
Fructose-bisphosphate aldolase A / 緑色蛍光タンパク質
類似検索 - 構成要素
生物種synthetic construct (人工物)
Oryctolagus cuniculus (ウサギ)
Aequorea victoria (オワンクラゲ)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3 Å
データ登録者Weaver, S.J. / Yao, Q.
資金援助 米国, 1件
組織認可番号国
National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS)P50 082545 米国
引用
ジャーナル: Structure / 年: 2019
タイトル: Fusion of DARPin to Aldolase Enables Visualization of Small Protein by Cryo-EM.
著者: Qing Yao / Sara J Weaver / Jee-Young Mock / Grant J Jensen /
要旨: Solving protein structures by single-particle cryoelectron microscopy (cryo-EM) has become a crucial tool in structural biology. While exciting progress is being made toward the visualization of ...Solving protein structures by single-particle cryoelectron microscopy (cryo-EM) has become a crucial tool in structural biology. While exciting progress is being made toward the visualization of small macromolecules, the median protein size in both eukaryotes and bacteria is still beyond the reach of cryo-EM. To overcome this problem, we implemented a platform strategy in which a small protein target was rigidly attached to a large, symmetric base via a selectable adapter. Of our seven designs, the best construct used a designed ankyrin repeat protein (DARPin) rigidly fused to tetrameric rabbit muscle aldolase through a helical linker. The DARPin retained its ability to bind its target: GFP. We solved the structure of this complex to 3.0 Å resolution overall, with 5-8 Å resolution in the GFP region. As flexibility in the DARPin position limited the overall resolution of the target, we describe strategies to rigidify this element.
#1: ジャーナル: Biorxiv / 年: 2018
タイトル: Fusion of DARPin to aldolase enables visualization of small protein by cryoEM
著者: Yao, Q. / Weaver, S.J. / Mock, J.Y. / Jensen, G.J.
履歴
登録2018年10月30日登録サイト: RCSB / 処理サイト: RCSB
改定 1.02018年11月21日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12019年5月29日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / citation_author
改定 1.22019年7月17日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation / Item: _citation.journal_volume / _citation.page_first
改定 1.32020年1月8日Group: Author supporting evidence / カテゴリ: pdbx_audit_support / Item: _pdbx_audit_support.funding_organization
改定 1.42024年3月13日Group: Data collection / Database references / Refinement description
カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond ...chem_comp_atom / chem_comp_bond / citation / database_2 / em_3d_fitting_list / pdbx_initial_refinement_model
Item: _citation.journal_id_ISSN / _database_2.pdbx_DOI ..._citation.journal_id_ISSN / _database_2.pdbx_DOI / _database_2.pdbx_database_accession / _em_3d_fitting_list.accession_code / _em_3d_fitting_list.initial_refinement_model_id / _em_3d_fitting_list.source_name / _em_3d_fitting_list.type

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構造の表示

ムービー
  • 生物学的単位 - author_defined_assembly
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • 登録構造単位
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • EMマップとの重ね合わせ
  • マップデータ: EMDB-9277
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
G: Green fluorescent protein
B: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
J: Green fluorescent protein
C: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
I: Green fluorescent protein
D: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
H: Green fluorescent protein


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)314,3498
ポリマ－314,3498
非ポリマー00
水0
1
A: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
G: Green fluorescent protein


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)78,5872
ポリマ－78,5872
非ポリマー00
水0
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
2
B: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
J: Green fluorescent protein


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)78,5872
ポリマ－78,5872
非ポリマー00
水0
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
3
C: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
I: Green fluorescent protein


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)78,5872
ポリマ－78,5872
非ポリマー00
水0
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
4
D: DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion
H: Green fluorescent protein


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)78,5872
ポリマ－78,5872
非ポリマー00
水0
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551

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要素

#1: タンパク質
DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusion / / Fructose-bisphosphate aldolase A


分子量: 53113.434 Da / 分子数: 4 / 由来タイプ: 組換発現
詳細: Rabbit (Oryctolagus cuniculus) muscle aldolase and a synthetic DARPin were fused to create this synthetic construct
由来: (組換発現) synthetic construct (人工物), (組換発現) Oryctolagus cuniculus (ウサギ)
プラスミド: pET21b / 遺伝子: ALDOA
詳細 (発現宿主): C-terminal His-tag of DARPin-aldolase chimeric fusion
発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 株 (発現宿主): BL21(DE3) / 参照: UniProt: P00883, fructose-bisphosphate aldolase
#2: タンパク質
Green fluorescent protein / 緑色蛍光タンパク質


分子量: 25473.697 Da / 分子数: 4 / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Aequorea victoria (オワンクラゲ)
遺伝子: GFP / プラスミド: pACYCDuet / 詳細 (発現宿主): no tag / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 株 (発現宿主): BL21(DE3) / 参照: UniProt: P42212

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来
1DARPin-aldolase platform in complex with GFPCOMPLEXall0RECOMBINANT
2DARPin, Muscle-type aldolase chimeric fusionCOMPLEX1RECOMBINANT
3Green fluorescent protein緑色蛍光タンパク質COMPLEX1RECOMBINANT
分子量値: 0.314 MDa / 実験値: NO
由来(天然)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
11synthetic construct (人工物)32630
22Aequorea victoria (オワンクラゲ)6100
由来(組換発現)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID株
11Escherichia coli (大腸菌)469008BL21 (DE3)
22Escherichia coli (大腸菌)469008BL21 (DE3)
緩衝液pH: 8
緩衝液成分
ID濃度名称式Buffer-ID
125 mMTris HCl1
2150 mMsodium chloride塩化ナトリウムNaCl塩化ナトリウム1
試料濃度: 2.5 mg/ml / 包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
詳細: The protein complex was then purified with Ni-NTA affinity chromatography (Qiagen), and Superdex 200 chromatography (GE healthcare). The purified GFP-DARPin-aldolase complex was concentrated ...詳細: The protein complex was then purified with Ni-NTA affinity chromatography (Qiagen), and Superdex 200 chromatography (GE healthcare). The purified GFP-DARPin-aldolase complex was concentrated to 2.5mg/ml in a buffer containing 25 mM Tris-HCl pH 8.0 and 150 mM NaCl.
試料支持グリッドの材料: GOLD / グリッドのサイズ: 300 divisions/in. / グリッドのタイプ: UltrAuFoil
急速凍結装置: HOMEMADE PLUNGER / 凍結剤: ETHANE / 湿度: 95 % / 凍結前の試料温度: 277.15 K
詳細: Grids were frozen on a manual plunger at the Scripps Research Institute Core Microscopy Facility in a 4 degrees C cold room humidified to >95%.

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELDBright-field microscopy / 倍率（公称値）: 165000 X / 最大 デフォーカス（公称値）: 30000 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 10000 nm / Cs: 2.7 mm / C2レンズ絞り径: 70 µm
試料ホルダ凍結剤: NITROGEN
試料ホルダーモデル: FEI TITAN KRIOS AUTOGRID HOLDER
撮影

Imaging-ID: 1 / 平均露光時間: 4 sec. / 検出モード: SUPER-RESOLUTION / フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 SUMMIT (4k x 4k) / 撮影したグリッド数: 1

ID電子線照射量 (e/Å2)実像数詳細
12.31133All three microscope sessions used grids frozen in the same session. In the first microscopy session the stage was untilted (0 degrees).
22.3548All three microscope sessions used grids frozen in the same session. In the second microscopy session the stage was untilted (0 degrees).
31.11180All three microscope sessions used grids frozen in the same session. In the third microscopy session the stage was tilted to 26 degrees.
電子光学装置エネルギーフィルター名称: GIF Quantum LS / エネルギーフィルタースリット幅: 20 eV
画像スキャン動画フレーム数/画像: 40 / 利用したフレーム数/画像: 1-40

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解析

EMソフトウェア
ID名称バージョンカテゴリ詳細
2SerialEM画像取得
3EPU画像取得
5CTFFIND4.1.10CTF補正whole micrographs
6RELION3.0 beta 2CTF補正Per particle CtfRefine
9UCSF Chimera1.12モデルフィッティングFit into map
11RELION3.0 beta 2初期オイラー角割当
12RELION3.0 beta 2最終オイラー角割当
14RELION3.0 beta 2３次元再構成
画像処理詳細: Particles from all three microscopy sessions were processed together.
CTF補正詳細: First whole micrograph correction with CtfFind4. Then per particle CTF Refinement in Relion.
タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
粒子像の選択選択した粒子像数: 851776
詳細: Manually picked particles were used to generate references for autopicking. Particles from all three microscopy sessions were processed together. Microscope session 1 - 358,381 particles ...詳細: Manually picked particles were used to generate references for autopicking. Particles from all three microscopy sessions were processed together. Microscope session 1 - 358,381 particles Microscope session 2 - 64,368 particles Microscope session 3 - 402,427 particles
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 3 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 236339 / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築プロトコル: RIGID BODY FIT
詳細: PDB models 5vy5 and 5ma6 were used as starting points. These models were mutated to match the sequence of the DARPin-aldolase platform in complex with GFP that were used. The PDB models were ...詳細: PDB models 5vy5 and 5ma6 were used as starting points. These models were mutated to match the sequence of the DARPin-aldolase platform in complex with GFP that were used. The PDB models were docked into the cryoEM density using Chimera fit into map function. No model refinement was used.
原子モデル構築

3D fitting-ID: 1 / Source name: PDB / タイプ: experimental model

IDPDB-IDPDB chain-IDAccession codeInitial refinement model-ID
15VY5

5vy5

A5VY51
25MA6

5ma6

A5MA62
35MA6

5ma6

B5MA62

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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