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万見
- PDB-6gtg: Transition state structure of Cpf1(Cas12a) I4 conformation -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 6gtg
タイトルTransition state structure of Cpf1(Cas12a) I4 conformation
要素
  • CRISPR-associated endonuclease Cas12a
  • DNA (32-MER)
  • DNA (5'-D(P*CP*GP*AP*GP*CP*TP*CP*GP*TP*TP*AP*GP*AP*GP*AP*AP*GP*T)-3')
  • RNA (40-MER)
キーワードHYDROLASE (加水分解酵素) / genome editing CRISPR ribonucleoprotein complex
機能・相同性
機能・相同性情報


枯草菌リボヌクレアーゼ / Bacillus subtilis ribonuclease activity / deoxyribonuclease I / deoxyribonuclease I activity / defense response to virus / lyase activity / DNA binding / RNA binding
類似検索 - 分子機能
CRISPR-associated endonuclease Cas12a / Cas12a, REC1 domain / Cas12a, RuvC nuclease domain / Cas12a, nuclease domain / Alpha helical recognition lobe domain / Nuclease domain / RuvC nuclease domain
類似検索 - ドメイン・相同性
デオキシリボ核酸 / DNA (> 10) / リボ核酸 / RNA (> 10) / CRISPR-associated endonuclease Cas12a
類似検索 - 構成要素
生物種Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.27 Å
データ登録者Mesa, P. / Montoya, G. / Stella, S.
資金援助 デンマーク, 1件
組織認可番号国
Novo Nordisk FoundationNNF14CC0001 デンマーク
引用ジャーナル: Cell / 年: 2018
タイトル: Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity.
著者: Stefano Stella / Pablo Mesa / Johannes Thomsen / Bijoya Paul / Pablo Alcón / Simon B Jensen / Bhargav Saligram / Matias E Moses / Nikos S Hatzakis / Guillermo Montoya /
要旨: Cas12a, also known as Cpf1, is a type V-A CRISPR-Cas RNA-guided endonuclease that is used for genome editing based on its ability to generate specific dsDNA breaks. Here, we show cryo-EM structures ...Cas12a, also known as Cpf1, is a type V-A CRISPR-Cas RNA-guided endonuclease that is used for genome editing based on its ability to generate specific dsDNA breaks. Here, we show cryo-EM structures of intermediates of the cleavage reaction, thus visualizing three protein regions that sense the crRNA-DNA hybrid assembly triggering the catalytic activation of Cas12a. Single-molecule FRET provides the thermodynamics and kinetics of the conformational activation leading to phosphodiester bond hydrolysis. These findings illustrate why Cas12a cuts its target DNA and unleashes unspecific cleavage activity, degrading ssDNA molecules after activation. In addition, we show that other crRNAs are able to displace the R-loop inside the protein after target DNA cleavage, terminating indiscriminate ssDNA degradation. We propose a model whereby the conformational activation of the enzyme results in indiscriminate ssDNA cleavage. The displacement of the R-loop by a new crRNA molecule will reset Cas12a specificity, targeting new DNAs.
履歴
登録2018年6月18日登録サイト: PDBE / 処理サイト: PDBE
改定 1.02018年12月19日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12018年12月26日Group: Data collection / Database references / カテゴリ: citation
Item: _citation.journal_volume / _citation.page_first / _citation.page_last
改定 1.22019年11月6日Group: Data collection / Refinement description / カテゴリ: software / Item: _software.name
改定 1.32019年12月18日Group: Other / カテゴリ: atom_sites
Item: _atom_sites.fract_transf_matrix[1][1] / _atom_sites.fract_transf_matrix[2][2] / _atom_sites.fract_transf_matrix[3][3]

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構造の表示

ムービー
  • 登録構造単位
  • Jmolによる作画
  • ダウンロード
  • EMマップとの重ね合わせ
  • マップデータ: EMDB-0065
  • UCSF Chimeraによる作画
  • ダウンロード
ムービービューア
構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: CRISPR-associated endonuclease Cas12a
B: RNA (40-MER)
C: DNA (32-MER)
D: DNA (5'-D(P*CP*GP*AP*GP*CP*TP*CP*GP*TP*TP*AP*GP*AP*GP*AP*AP*GP*T)-3')
ヘテロ分子


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)203,3788
ポリマ－203,2814
非ポリマー974
水543
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者・ソフトウェアが定義した集合体
  • 根拠: gel filtration, native gel electrophoresis
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551
Buried area19450 Å2
ΔGint-152 kcal/mol
Surface area69440 Å2
手法PISA

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要素

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DNA鎖 , 2種, 2分子 CD

#3: DNA鎖 DNA (32-MER)


分子量: 16898.826 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)
#4: DNA鎖 DNA (5'-D(P*CP*GP*AP*GP*CP*TP*CP*GP*TP*TP*AP*GP*AP*GP*AP*AP*GP*T)-3')


分子量: 16992.936 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)

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タンパク質 / RNA鎖 , 2種, 2分子 AB

#1: タンパク質 CRISPR-associated endonuclease Cas12a / CRISPR-associated endonuclease Cpf1 / FnCas12a / FnCpf1


分子量: 155639.828 Da / 分子数: 1 / 変異: E1006Q / 由来タイプ: 組換発現
由来: (組換発現) Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)
遺伝子: cas12a, cpf1, FTN_1397 / 発現宿主: Escherichia coli BL21 (大腸菌) / 参照: UniProt: A0Q7Q2, deoxyribonuclease I, EC: 3.1.27.2
#2: RNA鎖 RNA (40-MER)


分子量: 13749.146 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)

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非ポリマー , 2種, 7分子

#5: 化合物
ChemComp-MG / MAGNESIUM ION / マグネシウムジカチオン


分子量: 24.305 Da / 分子数: 4 / 由来タイプ: 合成 / 式: Mg
#6: 水 ChemComp-HOH / water / 水


分子量: 18.015 Da / 分子数: 3 / 由来タイプ: 天然 / 式: H2O

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来
1Transition state complex I4 conformationCOMPLEX#1-#40MULTIPLE SOURCES
2CRISPR-associated endonuclease Cas12aCOMPLEX#11RECOMBINANT
3RNA (28-mer)COMPLEX#21RECOMBINANT
4DNAデオキシリボ核酸COMPLEX#3-#41RECOMBINANT
分子量値: 0.180 MDa / 実験値: YES
由来(天然)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
12Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)401614
23Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)401614
34Francisella tularensis subsp. novicida U112 (バクテリア)401614
由来(組換発現)
IDEntity assembly-ID生物種Ncbi tax-ID
12Escherichia coli BL21 (大腸菌)511693
23synthetic construct (人工物)32630
34synthetic construct (人工物)32630
緩衝液pH: 6
試料包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
急速凍結凍結剤: ETHANE

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: SPOT SCAN
電子レンズモード: BRIGHT FIELDBright-field microscopy
撮影電子線照射量: 40 e/Å2 / 検出モード: COUNTING
フィルム・検出器のモデル: FEI FALCON III (4k x 4k)

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解析

ソフトウェア
名称バージョン分類
PHENIXdev_3071精密化
PHENIXdev_3071精密化
EMソフトウェア
ID名称カテゴリ
2EPU画像取得
4MotionCorr2CTF補正
7Cootモデルフィッティング
9PHENIXモデル精密化
13RELION３次元再構成
CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
対称性点対称性: C1 (非対称)
3次元再構成解像度: 3.27 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 358 / 対称性のタイプ: POINT
精密化立体化学のターゲット値: GeoStd + Monomer Library
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.008612971
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d1.055717860
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.05711960
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.00671969
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d10.39877582

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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