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- PDB-8hnv: CryoEM structure of HpaCas9-sgRNA-dsDNA in the presence of AcrIIC4 -

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基本情報

登録情報
データベース: PDB / ID: 8hnv
タイトルCryoEM structure of HpaCas9-sgRNA-dsDNA in the presence of AcrIIC4
要素
  • CRISPR-associated endonuclease Cas9
  • anti-CRISPR protein AcrIIC4
  • non-target strand
  • sgRNA
  • target strand
キーワードANTIMICROBIAL PROTEIN / Cas9 / cleavage inhibition / HYDROLASE-RNA-ANTIMICROBIAL PROTEIN complex
機能・相同性
機能・相同性情報


maintenance of CRISPR repeat elements / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / DNA binding / RNA binding / metal ion binding
類似検索 - 分子機能
RuvC endonuclease subdomain 3 / RuvC endonuclease subdomain 3 / CRISPR-associated endonuclease Cas9 / HNH endonuclease / Cas9-type HNH domain / Cas9-type HNH domain profile. / HNH nuclease / Ribonuclease H superfamily
類似検索 - ドメイン・相同性
DNA / DNA (> 10) / RNA / RNA (> 10) / RNA (> 100) / CRISPR-associated endonuclease Cas9
類似検索 - 構成要素
生物種Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
synthetic construct (人工物)
手法電子顕微鏡法 / 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 3.1 Å
データ登録者Sun, W. / Cheng, Z. / Wang, J. / Yang, X. / Wang, Y.
資金援助 中国, 1件
組織認可番号国
National Natural Science Foundation of China (NSFC) 中国
引用
ジャーナル: Proc Natl Acad Sci U S A / 年: 2023
タイトル: AcrIIC4 inhibits type II-C Cas9 by preventing R-loop formation.
著者: Wei Sun / Zhi Cheng / Jiuyu Wang / Jing Yang / Xueyan Li / Jinlong Wang / Minxuan Chen / Xiaoqi Yang / Gang Sheng / Jizhong Lou / Yanli Wang /
要旨: Anti-CRISPR (Acr) proteins are encoded by phages and other mobile genetic elements and inhibit host CRISPR-Cas immunity using versatile strategies. AcrIIC4 is a broad-spectrum Acr that inhibits the ...Anti-CRISPR (Acr) proteins are encoded by phages and other mobile genetic elements and inhibit host CRISPR-Cas immunity using versatile strategies. AcrIIC4 is a broad-spectrum Acr that inhibits the type II-C CRISPR-Cas9 system in several species by an unknown mechanism. Here, we determined a series of structures of Cas9 (HpaCas9)-sgRNA in complex with AcrIIC4 and/or target DNA, as well as the crystal structure of AcrIIC4 alone. We found that AcrIIC4 resides in the crevice between the REC1 and REC2 domains of HpaCas9, where its extensive interactions restrict the mobility of the REC2 domain and prevent the unwinding of target double-stranded (ds) DNA at the PAM-distal end. Therefore, the full-length guide RNA:target DNA heteroduplex fails to form in the presence of AcrIIC4, preventing Cas9 nuclease activation. Altogether, our structural and biochemical studies illuminate a unique Acr mechanism that allows DNA binding to the Cas9 effector complex but blocks its cleavage by preventing R-loop formation, a key step supporting DNA cleavage by Cas9.
#1: ジャーナル: mBio / 年: 2018
タイトル: Potent Cas9 Inhibition in Bacterial and Human Cells by AcrIIC4 and AcrIIC5 Anti-CRISPR Proteins.
著者: Jooyoung Lee / Aamir Mir / Alireza Edraki / Bianca Garcia / Nadia Amrani / Hannah E Lou / Ildar Gainetdinov / April Pawluk / Raed Ibraheim / Xin D Gao / Pengpeng Liu / Alan R Davidson / Karen ...著者: Jooyoung Lee / Aamir Mir / Alireza Edraki / Bianca Garcia / Nadia Amrani / Hannah E Lou / Ildar Gainetdinov / April Pawluk / Raed Ibraheim / Xin D Gao / Pengpeng Liu / Alan R Davidson / Karen L Maxwell / Erik J Sontheimer /
要旨: In their natural settings, CRISPR-Cas systems play crucial roles in bacterial and archaeal adaptive immunity to protect against phages and other mobile genetic elements, and they are also widely used ...In their natural settings, CRISPR-Cas systems play crucial roles in bacterial and archaeal adaptive immunity to protect against phages and other mobile genetic elements, and they are also widely used as genome engineering technologies. Previously we discovered bacteriophage-encoded Cas9-specific anti-CRISPR (Acr) proteins that serve as countermeasures against host bacterial immunity by inactivating their CRISPR-Cas systems (A. Pawluk, N. Amrani, Y. Zhang, B. Garcia, et al., Cell 167:1829-1838.e9, 2016, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.017). We hypothesized that the evolutionary advantages conferred by anti-CRISPRs would drive the widespread occurrence of these proteins in nature (K. L. Maxwell, Mol Cell 68:8-14, 2017, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.09.002; A. Pawluk, A. R. Davidson, and K. L. Maxwell, Nat Rev Microbiol 16:12-17, 2018, https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.120; E. J. Sontheimer and A. R. Davidson, Curr Opin Microbiol 37:120-127, 2017, https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.06.003). We have identified new anti-CRISPRs using the same bioinformatic approach that successfully identified previous Acr proteins (A. Pawluk, N. Amrani, Y. Zhang, B. Garcia, et al., Cell 167:1829-1838.e9, 2016, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.017) against Cas9 (NmeCas9). In this work, we report two novel anti-CRISPR families in strains of and , both of which harbor type II-C CRISPR-Cas systems (A. Mir, A. Edraki, J. Lee, and E. J. Sontheimer, ACS Chem Biol 13:357-365, 2018, https://doi.org/10.1021/acschembio.7b00855). We characterize the type II-C Cas9 orthologs from and , show that the newly identified Acrs are able to inhibit these systems, and define important features of their inhibitory mechanisms. The Acr is the most potent NmeCas9 inhibitor identified to date. Although inhibition of NmeCas9 by anti-CRISPRs from and reveals cross-species inhibitory activity, more distantly related type II-C Cas9s are not inhibited by these proteins. The specificities of anti-CRISPRs and divergent Cas9s appear to reflect coevolution of their strategies to combat or evade each other. Finally, we validate these new anti-CRISPR proteins as potent off-switches for Cas9 genome engineering applications. As one of their countermeasures against CRISPR-Cas immunity, bacteriophages have evolved natural inhibitors known as anti-CRISPR (Acr) proteins. Despite the existence of such examples for type II CRISPR-Cas systems, we currently know relatively little about the breadth of Cas9 inhibitors, and most of their direct Cas9 targets are uncharacterized. In this work we identify two new type II-C anti-CRISPRs and their cognate Cas9 orthologs, validate their functionality and in bacteria, define their inhibitory spectrum against a panel of Cas9 orthologs, demonstrate that they act before Cas9 DNA binding, and document their utility as off-switches for Cas9-based tools in mammalian applications. The discovery of diverse anti-CRISPRs, the mechanistic analysis of their cognate Cas9s, and the definition of Acr inhibitory mechanisms afford deeper insight into the interplay between Cas9 orthologs and their inhibitors and provide greater scope for exploiting Acrs for CRISPR-based genome engineering.
履歴
登録2022年12月8日登録サイト: PDBJ / 処理サイト: PDBJ
改定 1.02023年7月19日Provider: repository / タイプ: Initial release
改定 1.12023年8月2日Group: Database references / カテゴリ: citation / citation_author
Item: _citation.country / _citation.journal_abbrev ..._citation.country / _citation.journal_abbrev / _citation.journal_id_ASTM / _citation.journal_id_CSD / _citation.journal_id_ISSN / _citation.journal_volume / _citation.page_first / _citation.page_last / _citation.pdbx_database_id_DOI / _citation.pdbx_database_id_PubMed / _citation.title / _citation.year
改定 1.22024年7月3日Group: Data collection / カテゴリ: chem_comp_atom / chem_comp_bond / em_admin / Item: _em_admin.last_update

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構造の表示

構造ビューア分子:
MolmilJmol/JSmol

ダウンロードとリンク

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集合体

登録構造単位
A: CRISPR-associated endonuclease Cas9
B: sgRNA
C: target strand
D: non-target strand
E: anti-CRISPR protein AcrIIC4


分子量 (理論値)分子数
合計 (水以外)194,1705
ポリマ－194,1705
非ポリマー00
水00
1


  • 登録構造と同一
  • 登録者が定義した集合体
  • 根拠: gel filtration
タイプ名称対称操作数
identity operation1_5551

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要素

#1: タンパク質 CRISPR-associated endonuclease Cas9


分子量: 121605.695 Da / 分子数: 1 / 変異: D13A,H581A / 由来タイプ: 組換発現
詳細: Two mutations D13A and H581A were introduced to inactivate the catalytic sites of HpaCas9. The first residue 'Ser' of the sample sequence is the one expressed from the vector left after tag cleavage.
由来: (組換発現) Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
遺伝子: csn1 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 参照: UniProt: F0ET08
#2: RNA鎖 sgRNA


分子量: 40860.125 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
詳細: RNA is originally derived from Haemophilus parainfluenzae and modified by author.
由来: (合成) synthetic construct (人工物)
#3: DNA鎖 target strand


分子量: 10865.029 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
#4: DNA鎖 non-target strand


分子量: 10766.954 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 合成
由来: (合成) Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
#5: タンパク質 anti-CRISPR protein AcrIIC4


分子量: 10072.395 Da / 分子数: 1 / 由来タイプ: 組換発現
詳細: WP_049372635.1;The first residue 'Ser' of the sample sequence is the one expressed from the vector left after tag cleavage.
由来: (組換発現) Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
遺伝子: acrIIC4 / 発現宿主: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)

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実験情報

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実験

実験手法: 電子顕微鏡法
EM実験試料の集合状態: PARTICLE / ３次元再構成法: 単粒子再構成法

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試料調製

構成要素
ID名称タイプEntity IDParent-ID由来
1Complex of HpaCas9-sgRNA-DNA in the presence of AcrIIC4COMPLEXall0MULTIPLE SOURCES
2HpaCas9/AcrIIC4COMPLEX#1, #51RECOMBINANT
3RNA/DNACOMPLEX#2-#41SYNTHETIC
分子量値: 0.194 MDa / 実験値: YES
由来(天然)生物種: Haemophilus parainfluenzae (パラインフルエンザ菌)
由来(組換発現)生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌)
緩衝液pH: 7.5
緩衝液成分
ID濃度名称式Buffer-ID
1100 mMsodium chlorideNaCl1
220 mMtris(hydroxymethyl)aminomethaneTris1
試料包埋: NO / シャドウイング: NO / 染色: NO / 凍結: YES
急速凍結凍結剤: ETHANE / 湿度: 100 % / 凍結前の試料温度: 277 K

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電子顕微鏡撮影

実験機器
モデル: Titan Krios / 画像提供: FEI Company
顕微鏡モデル: FEI TITAN KRIOS
電子銃電子線源: FIELD EMISSION GUN / 加速電圧: 300 kV / 照射モード: FLOOD BEAM
電子レンズモード: BRIGHT FIELD / 最大 デフォーカス（公称値）: 1600 nm / 最小 デフォーカス（公称値）: 1000 nm
撮影電子線照射量: 60 e/Å2
フィルム・検出器のモデル: GATAN K2 QUANTUM (4k x 4k)

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解析

CTF補正タイプ: PHASE FLIPPING AND AMPLITUDE CORRECTION
3次元再構成解像度: 3.1 Å / 解像度の算出法: FSC 0.143 CUT-OFF / 粒子像の数: 212049 / 対称性のタイプ: POINT
原子モデル構築プロトコル: RIGID BODY FIT
精密化交差検証法: NONE
立体化学のターゲット値: GeoStd + Monomer Library + CDL v1.2
原子変位パラメータBiso mean: 17.66 Å2
拘束条件
Refine-IDタイプDev ideal数
ELECTRON MICROSCOPYf_bond_d0.00239613
ELECTRON MICROSCOPYf_angle_d0.550713550
ELECTRON MICROSCOPYf_chiral_restr0.03551624
ELECTRON MICROSCOPYf_plane_restr0.00411264
ELECTRON MICROSCOPYf_dihedral_angle_d17.90042339

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万見について

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お知らせ

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2022年2月9日: EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

EMDBエントリの付随情報ファイルのフォーマットが新しくなりました

  • EMDBのヘッダファイルのバージョン3が、公式のフォーマットとなりました。
  • これまでは公式だったバージョン1.9は、アーカイブから削除されます。

関連情報:EMDBヘッダ

外部リンク:wwPDBはEMDBデータモデルのバージョン3へ移行します

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2020年8月12日: 新型コロナ情報

新型コロナ情報

URL: https://pdbjlc1.pdbj.org/emnavi/covid19.php

新ページ: EM Navigatorに新型コロナウイルスの特設ページを開設しました。

関連情報:Covid-19情報 / 2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

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2020年3月5日: 新型コロナウイルスの構造データ

新型コロナウイルスの構造データ

関連情報:万見生物種 / 2020年8月12日: 新型コロナ情報

外部リンク:COVID-19特集ページ - PDBj / 今月の分子2020年2月：コロナウイルスプロテーアーゼ

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2019年1月31日: EMDBのIDの桁数の変更

EMDBのIDの桁数の変更

  • EMDBエントリに付与されているアクセスコード(EMDB-ID)は4桁の数字(例、EMD-1234)でしたが、間もなく枯渇します。これまでの4桁のID番号は4桁のまま変更されませんが、4桁の数字を使い切った後に発行されるIDは5桁以上の数字(例、EMD-12345)になります。5桁のIDは2019年の春頃から発行される見通しです。
  • EM Navigator/万見では、接頭語「EMD-」は省略されています。

関連情報:Q: 「EMD」とは何ですか？ / 万見/EM NavigatorにおけるID/アクセスコードの表記

外部リンク:EMDB Accession Codes are Changing Soon! / PDBjへお問い合わせ

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2017年7月12日: PDB大規模アップデート

PDB大規模アップデート

  • 新バージョンのPDBx/mmCIF辞書形式に基づくデータがリリースされました。
  • 今回の更新はバージョン番号が4から5になる大規模なもので、全エントリデータの書き換えが行われる「Remediation」というアップデートに該当します。
  • このバージョンアップで、電子顕微鏡の実験手法に関する多くの項目の書式が改定されました(例：em_softwareなど)。
  • EM NavigatorとYorodumiでも、この改定に基づいた表示内容になります。

外部リンク:wwPDB Remediation / OneDepデータ基準に準拠した、より強化された内容のモデル構造ファイルが、PDBアーカイブで公開されました。

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万見 (Yorodumi)

幾万の構造データを、幾万の視点から

  • 万見(Yorodumi)は、EMDB/PDB/SASBDBなどの構造データを閲覧するためのページです。
  • EM Navigatorの詳細ページの後継、Omokage検索のフロントエンドも兼ねています。

関連情報:EMDB / PDB / SASBDB / 3つのデータバンクの比較 / 万見検索 / 2016年8月31日: 新しいEM Navigatorと万見 / 万見文献 / Jmol/JSmol / 機能・相同性情報 / 新しいEM Navigatorと万見の変更点

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