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-基本情報
登録情報 | データベース: EMDB / ID: EMD-5929 | |||||||||
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タイトル | CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference | |||||||||
マップデータ | Cryo-EM reconstruction of Cascade bound to a 72 bp target dsDNA | |||||||||
試料 |
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キーワード | Cascade / CRISPR RNA / Cas3 / bacterial immunity | |||||||||
機能・相同性 | 機能・相同性情報 protein-containing complex => GO:0032991 / : / CRISPR / protein binding / DNA/RNA hybrid binding / maintenance of CRISPR repeat elements / 転写後修飾 / RNA endonuclease activity / endonuclease activity / defense response to virus ...protein-containing complex => GO:0032991 / : / CRISPR / protein binding / DNA/RNA hybrid binding / maintenance of CRISPR repeat elements / 転写後修飾 / RNA endonuclease activity / endonuclease activity / defense response to virus / 加水分解酵素; エステル加水分解酵素 / nucleic acid binding / protein-containing complex / DNA binding / RNA binding / zinc ion binding 類似検索 - 分子機能 | |||||||||
生物種 | Escherichia coli K-12 (大腸菌) / Enterobacteria phage P7 (ファージ) | |||||||||
手法 | 単粒子再構成法 / クライオ電子顕微鏡法 / 解像度: 9.0 Å | |||||||||
データ登録者 | Hochstrasser ML / Taylor DW / Bhat P / Guegler CK / Sternberg SH / Nogales E / Doudna JA | |||||||||
引用 | ジャーナル: Proc Natl Acad Sci U S A / 年: 2014 タイトル: CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference. 著者: Megan L Hochstrasser / David W Taylor / Prashant Bhat / Chantal K Guegler / Samuel H Sternberg / Eva Nogales / Jennifer A Doudna / 要旨: In bacteria, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated (Cas) DNA-targeting complex Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense) uses CRISPR RNA ...In bacteria, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated (Cas) DNA-targeting complex Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense) uses CRISPR RNA (crRNA) guides to bind complementary DNA targets at sites adjacent to a trinucleotide signature sequence called the protospacer adjacent motif (PAM). The Cascade complex then recruits Cas3, a nuclease-helicase that catalyzes unwinding and cleavage of foreign double-stranded DNA (dsDNA) bearing a sequence matching that of the crRNA. Cascade comprises the CasA-E proteins and one crRNA, forming a structure that binds and unwinds dsDNA to form an R loop in which the target strand of the DNA base pairs with the 32-nt RNA guide sequence. Single-particle electron microscopy reconstructions of dsDNA-bound Cascade with and without Cas3 reveal that Cascade positions the PAM-proximal end of the DNA duplex at the CasA subunit and near the site of Cas3 association. The finding that the DNA target and Cas3 colocalize with CasA implicates this subunit in a key target-validation step during DNA interference. We show biochemically that base pairing of the PAM region is unnecessary for target binding but critical for Cas3-mediated degradation. In addition, the L1 loop of CasA, previously implicated in PAM recognition, is essential for Cas3 activation following target binding by Cascade. Together, these data show that the CasA subunit of Cascade functions as an essential partner of Cas3 by recognizing DNA target sites and positioning Cas3 adjacent to the PAM to ensure cleavage. | |||||||||
履歴 |
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-構造の表示
ムービー |
ムービービューア |
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構造ビューア | EMマップ: SurfViewMolmilJmol/JSmol |
添付画像 |
-ダウンロードとリンク
-EMDBアーカイブ
マップデータ | emd_5929.map.gz | 175.1 KB | EMDBマップデータ形式 | |
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ヘッダ (付随情報) | emd-5929-v30.xml emd-5929.xml | 19.3 KB 19.3 KB | 表示 表示 | EMDBヘッダ |
画像 | emd_5929.png | 331.9 KB | ||
アーカイブディレクトリ | http://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-5929 ftp://ftp.pdbj.org/pub/emdb/structures/EMD-5929 | HTTPS FTP |
-関連構造データ
-リンク
EMDBのページ | EMDB (EBI/PDBe) / EMDataResource |
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「今月の分子」の関連する項目 |
-マップ
ファイル | ダウンロード / ファイル: emd_5929.map.gz / 形式: CCP4 / 大きさ: 2.1 MB / タイプ: IMAGE STORED AS FLOATING POINT NUMBER (4 BYTES) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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注釈 | Cryo-EM reconstruction of Cascade bound to a 72 bp target dsDNA | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ボクセルのサイズ | X=Y=Z: 2.18 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
密度 |
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対称性 | 空間群: 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
詳細 | EMDB XML:
CCP4マップ ヘッダ情報:
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-添付データ
-試料の構成要素
-全体 : Cascade bound to a 72 bp target dsDNA
全体 | 名称: Cascade bound to a 72 bp target dsDNA |
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要素 |
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-超分子 #1000: Cascade bound to a 72 bp target dsDNA
超分子 | 名称: Cascade bound to a 72 bp target dsDNA / タイプ: sample / ID: 1000 集合状態: 1 CasA: 2 CasB: 6 CasC: 1 CasD: 1 CasE: 1 crRNA: 1 target dsDNA Number unique components: 7 |
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分子量 | 理論値: 443.8 KDa |
-分子 #1: CRISPR system Cascade subunit CasA
分子 | 名称: CRISPR system Cascade subunit CasA / タイプ: protein_or_peptide / ID: 1 Name.synonym: CRISPR type I-E/Ecoli-associated protein CasA/Cse1, CRISPR-associated protein CasA/Cse1, CasA, Cse1 コピー数: 1 / 集合状態: monomer / 組換発現: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 55.9 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: BL21(DE3) |
配列 | UniProtKB: CRISPR system Cascade subunit CasA GO: defense response to virus, DNA binding, RNA binding, protein-containing complex => GO:0032991 InterPro: CRISPR-associated protein Cse1 |
-分子 #2: CRISPR system Cascade subunit CasB
分子 | 名称: CRISPR system Cascade subunit CasB / タイプ: protein_or_peptide / ID: 2 / Name.synonym: CasB, Cse2 / コピー数: 2 / 集合状態: dimer / 組換発現: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 18.7 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: BL21(DE3) |
配列 | UniProtKB: CRISPR system Cascade subunit CasB GO: defense response to virus, RNA binding, protein-containing complex => GO:0032991 InterPro: CRISPR-associated protein Cse2 |
-分子 #3: CRISPR system Cascade subunit CasC
分子 | 名称: CRISPR system Cascade subunit CasC / タイプ: protein_or_peptide / ID: 3 / Name.synonym: CasC, Cas4, Cse4 詳細: The 6 CasC subunits make a helical stack forming a groove in which the crRNA lies. コピー数: 6 / 集合状態: helical / 組換発現: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 40 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: BL21(DE3) |
配列 | UniProtKB: CRISPR system Cascade subunit CasC GO: defense response to virus, RNA binding, protein-containing complex => GO:0032991, protein binding InterPro: CRISPR-associated protein, CT1975 |
-分子 #4: CRISPR system Cascade subunit CasD
分子 | 名称: CRISPR system Cascade subunit CasD / タイプ: protein_or_peptide / ID: 4 / Name.synonym: CasD, Cas5 / コピー数: 1 / 集合状態: monomer / 組換発現: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 25.2 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: BL21(DE3) |
配列 | UniProtKB: CRISPR system Cascade subunit CasD GO: defense response to virus, RNA binding, protein-containing complex => GO:0032991 InterPro: CRISPR-associated protein, Cas5, CRISPR-associated protein Cas5, N-terminal, CRISPR-associated protein, CasD |
-分子 #5: CRISPR system Cascade subunit CasE
分子 | 名称: CRISPR system Cascade subunit CasE / タイプ: protein_or_peptide / ID: 5 Name.synonym: CasE, Cas6e, CasE endoRNase, crRNA endonuclease コピー数: 1 / 集合状態: monomer / 組換発現: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 22.3 KDa |
組換発現 | 生物種: Escherichia coli BL21(DE3) (大腸菌) / 組換株: BL21(DE3) |
配列 | UniProtKB: CRISPR system Cascade subunit CasE GO: defense response to virus, RNA binding, protein-containing complex => GO:0032991, 転写後修飾, GO: 0090305, endonuclease activity InterPro: CRISPR-associated protein Cse3 |
-分子 #6: R44 CRISPR RNA
分子 | 名称: R44 CRISPR RNA / タイプ: rna / ID: 6 / Name.synonym: crRNA / 分類: OTHER / Structure: OTHER / Synthetic?: No |
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由来(天然) | 生物種: Escherichia coli K-12 (大腸菌) / 株: K-12 / 別称: E. coli |
分子量 | 理論値: 18.6 KDa |
配列 | 文字列: AUAAACCGAC GGUAUUGUUC AGAUCCUGGC UUGCCAACAG GAGUUCCCCG CGCCAGCGGG G |
-分子 #7: 72 bp dsDNA target with R44 protospacer
分子 | 名称: 72 bp dsDNA target with R44 protospacer / タイプ: dna / ID: 7 / Name.synonym: dsDNA target 詳細: This strand is annealed to the complementary non-target strand to form the dsDNA target. 分類: DNA / Structure: DOUBLE HELIX / Synthetic?: Yes |
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由来(天然) | 生物種: Enterobacteria phage P7 (ファージ) |
分子量 | 理論値: 44.4 KDa |
配列 | 文字列: CATGAGGTCC CTCGTTTAGT CTGTTGGCAA GCCAGGATCT GAACAATACC GTCATCGGAG GTACGATCAA GG |
-実験情報
-構造解析
手法 | クライオ電子顕微鏡法 |
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解析 | 単粒子再構成法 |
試料の集合状態 | particle |
-試料調製
濃度 | 2.3 mg/mL |
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緩衝液 | pH: 7.5 詳細: 50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCl, 5% glycerol, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP |
グリッド | 詳細: C-flat 2/2 |
凍結 | 凍結剤: ETHANE / チャンバー内湿度: 100 % / チャンバー内温度: 78 K / 装置: FEI VITROBOT MARK I 手法: A 4 uL drop of purified sample was placed onto C-flat grids that had been glow-discharged in a nitrogen atmosphere for 60 seconds using an Edwards Carbon Evaporator. The grids were blotted ...手法: A 4 uL drop of purified sample was placed onto C-flat grids that had been glow-discharged in a nitrogen atmosphere for 60 seconds using an Edwards Carbon Evaporator. The grids were blotted for 4 seconds using a blotting offset of -1 mm. |
-電子顕微鏡法
顕微鏡 | FEI TECNAI 20 |
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電子線 | 加速電圧: 120 kV / 電子線源: FIELD EMISSION GUN |
電子光学系 | 照射モード: FLOOD BEAM / 撮影モード: BRIGHT FIELDBright-field microscopy / Cs: 2.2 mm / 最大 デフォーカス(公称値): -2.8 µm / 最小 デフォーカス(公称値): -1.0 µm / 倍率(公称値): 100000 |
試料ステージ | 試料ホルダー: side entry / 試料ホルダーモデル: GATAN LIQUID NITROGEN |
温度 | 平均: 78 K |
アライメント法 | Legacy - 非点収差: Objective lens astigmatism was corrected at 100,000 times magnification. Legacy - Electron beam tilt params: 0 |
詳細 | Data acquired using Leginon. |
日付 | 2012年12月26日 |
撮影 | カテゴリ: CCD フィルム・検出器のモデル: GATAN ULTRASCAN 4000 (4k x 4k) 実像数: 3580 / 平均電子線量: 20 e/Å2 |
Tilt angle min | 0 |
Tilt angle max | 0 |
-画像解析
CTF補正 | 詳細: Whole micrograph |
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最終 再構成 | アルゴリズム: OTHER / 解像度のタイプ: BY AUTHOR / 解像度: 9.0 Å / 解像度の算出法: OTHER / ソフトウェア - 名称: EMAN2, SPARX / 使用した粒子像数: 280000 |
詳細 | Image pre-processing performed in Appion. Particles were selected using template-based picking in Appion. |